Набор для анализа CHIP (магнитный)

артикулА.CH1581/CF1581/CM1581/CG1581

Условия храненияА.4ºC Сохранить

инструкция по эксплуатации

Набор для тестирования CHIP используется для осаждения фрагментов хроматина, связанных с целевым белком, путем иммунного осаждения и, наконец, для обнаружения осажденных фрагментов хроматина с помощью таких методов, как PCR или Southern. Обычно используется для определения того, находится ли геномный ДНК - связывающий белок, такой как конкретный транскрипционный фактор или гистон, в том же комплексе, что и ожидаемая конкретная геномная последовательность ДНК. Тестирование ChIP позволяет сделать вывод о том, находится ли целевой белок в организме (In Vivo) и предполагаемый фрагмент ДНК генома в одном и том же комплексе. Результаты теста ChIP дают понять, что это соединение действительно происходит в клетке.

книгаНабор для обнаружения ChIP использует HA / DYKDDDDDK / Myc / GFP - Nanoab - Magnetic Beads в качестве растягивающейся бусины CHIP с высокой нагрузкой и высокой синергией, а также экономией времени и эффективности. Набор реагентов содержит предварительно смешанные контрольные экстракты (Control Primers), которые могут быть использованы для расширения части соответствующей последовательности Human GAPDH с последовательностью экстрактов: 5 '- TACTAGCGTTTACGGCG - 3'; 5’-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3’。

Оперативные шаги (только для информации):

Оптимизация условий ультразвуковой обработки образцов:

Приготовьте умеренное количество предварительно охлажденных PBS, а также 100 мм PMSF. Надлежащая теплая ванна SDS Lysis Buffer полностью растворяет и смешивает SDS.

2. Культивирование клеток в чашке Петри клетки 250px, использование клеточной питательной жидкости составляет 10 мл. В ожидаемое время соединения белка цели и геномной ДНК добавляется соответствующее количество формальдегида непосредственно в клеточную культурную жидкость, слегка смешивается до конечной концентрации 1%. Затем инкубация в течение 10 минут при 37ºC, чтобы соединить белки назначения и соответствующую геномную ДНК. Пример: В случае добавления 10 мл клеточной питательной жидкости в чашку Петри клетки 250px необходимо добавить 270ul 37% формальдегида. Обратите внимание на максимально высокое качество формальдегида в течение срока его полезного использования. Клетки также могут культивироваться в чашке Петри клеток 150px, и количество соответствующего раствора должно быть скорректировано пропорционально.

Добавьте 1.1мл Glycine Solution (10X), слегка перемешайте. Поместите комнатную температуру на 5 минут.

Поместите чашку Петри с образцами клеток на ледяную ванну. Высасывайте питательную жидкость, содержащую формальдегид и глицин, и старайтесь оставаться без остатков жидкости.

Поместите при комнатной температуре в течение 5 минут, разбавляя 100 мм PMSF до 1 мм предварительно охлажденным PBS, то есть PBS с 1 мм PMSF, предварительно охлажденным в ледяной ванне. Водный раствор PMSF должен быть свежеприготовлен, а период полураспада в водной фазе составляет около 30 мин.

Добавьте 5 - 10 мл предварительно охлажденного PBS (содержит 1 мм PMSF), промывайте клетки, высасывайте жидкость и старайтесь оставаться без остатков жидкости.

Добавьте 5 - 10 мл предварительно охлажденного PBS (включая 1 мм PMSF), чтобы дополнительно вымыть клетки, высосать жидкость и попытаться сохранить ее без остатков жидкости.

8. Добавьте 1 мл предварительно охлажденного PBS (с 1 мм PMSF), скребите клетку клеточным скребком и соберите в центробежную трубку. Если клетка может быть взорвана с помощью пистолета, ее можно также взорвать с помощью пистолета. Клетки подсчитываются и распределяются примерно по миллиону клеток на трубку.

9.4ºC, 800 - 1000g центрифуг в течение 1 - 2 минут, адекватное осаждение клеток. Если обнаруживается недостаточное осаждение, время центрифугирования может быть соответствующим образом увеличено. Высасывайте до конца, минимизируйте остатки жидкости.

Составьте SDS Lysis Buffer, содержащий 1 мм PMSF. Предыдущий 1 миллион клеток осаждается с 0,2 мл SDS Lysis Buffer, содержащим 1 мм PMSF.

Инкубируйте на ледяной ванне в течение 10 минут, чтобы полностью расщепить клетки.

12. Ультразвуковая обработка позволяет вырезать геномную ДНК таким образом, что большая часть ДНК распадается до размера 200 - 1000 bp, и лучше контролировать большую часть фрагментов на уровне 400 - 800 bp. Во время ультразвука обратите внимание, что образец должен находиться в ледяной ванне и поддерживать низкую температуру. Эффект ультразвукового сдвига может быть обнаружен с помощью обычного электрофореза ДНК агар гель после последующего скрещивания. Условия ультразвуковой обработки обычно могут быть установлены на 10 секунд каждый, в общей сложности 3 - 4 раза, при мощности 50 Вт на 30% от максимальной мощности с использованием 2 - мм ультразвуковой головки.

Настройки различных ультразвуковых инструментов не очень одинаковы, при изучении ультразвуковых условий, вы можете сначала зафиксировать другие условия, сначала определить, как долго каждый ультразвук не приведет к заметному нагреванию, а затем исследовать различные количества ультразвуков. До тех пор, пока не будет найдено подходящее количество ультразвуковых исследований,ДНК разрывается на 200 - 1000bp. Обратите внимание, что каждый ультразвуковой объем и количество клеток должны быть фиксированы, иначе для последующих экспериментов нельзя использовать относительно фиксированные ультразвуковые условия.

примечание: В постультразвуковом геномеПри обнаружении размера ДНК, если используется метод точечного окрашивания агаридным гелем (то есть добавление красителей нуклеиновой кислоты в loading buffer) или клеевое окрашивание, так как SDS связывается с такими красителями во время электрофореза, образуя ненормальные полосы, которые обычно составляют около 500 - 1000bp, это оказывает определенное влияние на определение размера ДНК в постультразвуковом геноме. Рекомендуется использовать постхромосомный метод для определения размера полосы, который не будет иметь аномальных полос, не влияет на определение размера ДНК в постультразвуковом геноме и более точный размер полосы.

13. Добавление 8ul 5M NaCl в 0,2 мл ультразвуковых образцов для усвоения. 65 °C нагревается в течение 4 часов, чтобы удалить соединение между белком и геномной ДНК.

Добавление равнообъемного баланса трисаБензолфен，Вортекс сильно перемешался, затем 4ºC, 12000g около центрифуги в течение 5 минут. Высасывание в другую центрифужную трубку.

15. Добавьте изообъемный хлороформ, vortex сильно перемешивается, а затем 4ºC, около 12000 г центрифуги 5 мин. Высасывание в другую центрифужную трубку.

примечаниеА.Экстракция фенолхлороформа на этапах 14 и 15 выше может осуществляться с использованием наборов для очистки ДНК.

16. Небольшое количество жидкости, полученной путем экстракции фенолхлороформа или в наборе для очистки ДНК, может быть взято 5 - 10ul для продуктов экстракции фенолхлороформа, 2 - 5ul для продуктов очистки в наборе для очистки ДНК, электрофорез агаринового геля для наблюдения за эффектом сдвига геномной ДНК при ультразвуковой обработке.

II. Иммунное осаждение хроматина:

1. После оптимизации условий ультразвуковой обработки образцов в соответствии сОптимизация условий ультразвуковой обработки образцовчжун1 - 11Шаги для выполнения операции и ссылки на шаги12 Проводится ультразвуковая обработка.

2. Для образцов, прошедших ультразвуковую обработку, при 4ºC 1200 - 1400 г центрифуги 5 мин. Возьмите очищение (около 0,2 мл) в 2 мл центробежных труб и поместите в ледяную ванну.

Составьте ChIP Dilution Buffer, содержащий 1 мм PMSF. Добавьте 1,8 мл ChIP Dilution Buffer, содержащий 1 мм PMSF, чтобы разбавить ультразвуковой образец, делая конечный объем 2 мл.

Взять образец 20ul в качестве Input для последующего тестирования. Б20ул HA/DYKDDDDK/Myc/GFP-Nanoab-Магнитные бисерыдобавитьРаствор PBS или TBST до 500ul для очистки методом дутья, помещаемый на магнитную раму, тщательно смывается с помощью переносчика и повторно промывается 2 - 3 раза (для лучшего уменьшения неспецифичности 1 также можно предварительно обработать Beads 1 час с 1 - 5% BSA или обезжиренным молоком).

5.Помыть или закрыть хорошо20ул HA/DYKDDDDK/Myc/GFP-Nanoab-Магнитные бисерыШаги присоединения3 В оставшихся образцах в качестве пустых контрольных могут использоваться растворы безрецептурных образцов, а также образцы без бидов в качестве отрицательных контрольных или несвязанных антител в качестве отрицательных. Медленное вращение или качание при 4ºC смешивается на 30 - 60мин для осаждения белка назначения или соответствующего комплекса.

6. Поместите вышеуказанные центробежные трубки, содержащие образцы, на магнитную раму 10s. Очень осторожно удалите верхнюю очистку, не касайтесь осаждения. Затем осадок последовательно промывают следующим раствором, каждый промыватель использует 1 мл, каждый раз медленно вращается или качается 3 - 5 мин при 4ºC, затем помещается на магнитную раму 10s. Осторожно удаляйте очищающую жидкость, не касайтесь осаждения.

(a) Промыть один раз Low Salt Immune Complex Wash Buffer.

(b) High Salt Immune Complex Wash Buffer стирается один раз.

(c) Мойка LiCl Immune Complex Wash Buffer.

(d) TE Buffer стирается дважды.

примечаниеА.Осадок, полученный после всех вышеописанных этапов промывки, может быть использован для расшифровки последовательности генов PCR или для обнаружения последовательности генов с помощью Southern или для тестирования Western.

III.Генетические последовательности с расширенной целью PCR (например, продукты ChIP используются для обнаружения последовательности генов с целью):

Свежая приготовленная умеренная доза Elution buffer (1% SDS, 0,1 м NaHCO3).

2. Шаги по завершениюЭтапы иммунологического осаждения第7Шаг за шагом, то есть после завершения всех этапов стирки, добавить250ul Elution buffer。 Vortex смешивается, вращается или качается при комнатной температуре и продолжает смываться в течение 3 - 5 минут.

Поместите на магнитную раму для отделения в течение 10 секунд и переместите верхнюю очистку в новую центробежную трубку. В осадок добавляется 250ul Elution Buffer. Vortex смешивается, вращается или качается при комнатной температуре и продолжает смываться в течение 3 - 5 минут.

4. Поместите на магнитную раму для отделения в течение 10 секунд и удалите верхнюю очистку. Объединение с предыдущим этапом те этапом 3. Всего около 500ul.

Добавить 20ul 5M NaCl в 500ul выше, чтобы перемешать. 65 °C нагревается в течение 4 часов, чтобы удалить соединение между белком и геномной ДНК. Для 20ul - образца, полученного в качестве Input на этапе 2D, добавьте 1ul 5M NaCl, который смешивается и нагревается при температуре 65ºC в течение 4 часов, что также используется для удаления сцепления между белком и геномной ДНК. Последующие шаги могут быть продолжены после того, как этот шаг будет завершен, или могут быть заморожены до 20ºC, а последующие шаги могут быть продолжены на следующий день.

примечание1На данный момент образцы уже можно использоватьPCR， Можно попробовать использовать образцы 1, 2, 5 или 10ul в качестве шаблонов для генов, предназначенных для тестирования методом PCR. Эффект PCR в этот момент зависит от количества ДНК, которое может быть осаждено, и от того, легко ли вся система амплификации PCR усиливает ген назначения. В случае обнаружения неудовлетворительного результата PCR можно рассмотреть возможность проведения повторного теста PCR путем последующей очистки и обогащения образца.

примечание2:: Как правило, рекомендуется провести последующую очистку послеТестирование PCR, Input, как правило, не требует последующих этапов очистки.

6. Добавление 10ul 0.5M EDTA, 20ul 1M Tris pH 6.5 и 1ul 20mg / мл протеазы K в образцы размером примерно 520ul.

Добавление равнообъемного баланса TrisБензолфен，Вортекс сильно перемешался, затем 4ºC, 12000g около центрифуги в течение 5 минут. Высасывание в другую центрифужную трубку.

8. Добавьте равнообъемный хлороформ, vortex сильно перемешивается, затем 4ºC, около 12000 г центрифуги в течение 5 минут. Высасывание в другую центрифужную трубку.

Добавьте 20ug glycogen или yeast tRNA, добавьте 1 / 10 объема 3M NaAc, pH5.2 и добавьте 2,5 - кратный объем безводного этанола. После смешивания - 70ºC осаждается не менее 1 часа или - 20ºC более 8 часов.

10.4ºC, 12000 - 1400g центрифуга в течение 10 минут, осторожно всасывайте большую часть верхней очистки, не касайтесь осаждения.

11. Добавьте около 1 мл 70% этанола для промывки и осаждения. 4ºC, 12000 - 1400g центрифуга 10min, осторожно всасывайте большую часть верхней очистки, не вступайте в контакт с осаждением.

12.4ºC, 12000 - 1400g центрифуга 1мин, осторожно высасывая остаточную жидкость.

13. Перевисящая ДНК осаждается небольшими количествами TE или воды для тестирования методом PCR гена назначения. Экстракт для PCR лучше всего спроектировать на 2 группы, используя Input в качестве шаблона, чтобы заранее определить соответствующие условия PCR и выбрать более эффективный набор экстрактов для окончательного теста PCR. В редких случаях, когда полоса PCR слишком слаба, можно использовать технологию NESTED PCR для двухколесного расширения.

примечание: ШагиЭтапы 7 - 13 также могут очищать ДНК с помощью соответствующих наборов для очистки ДНК.

IV.Western обнаруживает продукты ChIP (если продукты ChIP используются для обнаружения Western):

1. Последующие шагиИммунный осаждение хроматина第8 шагов, после завершения всех этапов промывки, добавьте 25ul SDS - PAGE белковый верхний буфер (1x). Буфер верхнего образца белка SDS - PAGE (1X) может быть получен путем разбавления водой буфера верхнего образца белка SDS - PAGE (5X). Кипящая ванна кипит в течение 10 минут.

2. Возьмите 10 - 20ul для тестирования Western.

Внимание:

Требуется собственный монорезистентный для ChIP, 37% формальдегида, PBS，PMSF，Elutioin (1% SDS, 0.1M NaHCO3)， Протаза K, Glycogen или tRNA, баланс трисаБензолфенХлороформ,95% этанол, 70% этанол, 3M NaAc (pH5.2) и магнитный каркас, клеточный скребок или клеточная лопата.

Требуется собственный ультразвуковой измельчитель образцов (sonicator), также известный как ультразвуковой измельчитель или ультразвуковой измельчитель клеток.

При использовании формальдегида, работайте в вентиляционном шкафу.

Продукт ограничен научными исследованиями специалистов, не может использоваться для клинической диагностики или лечения, не может использоваться для продуктов питания или лекарств, не может храниться в обычных жилых помещениях.

Для вашей безопасности и здоровья, пожалуйста, наденьте лабораторный костюм и используйте одноразовые перчатки.