Безклеточный набор для экспрессии белка (расширенная версия с дисульфидной связью)

артикул：P0243

Условия храненияА.-80℃，1годэффективный

Транспорт сухого льда. После вскрытия компоненты реакции экспрессии без клеточного белка помещаются в хранилище - 80°C. Чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания, жидкости A и B могут быть разделены и заморожены жидким азотом, а затем помещены на хранение при температуре 80°C в зависимости от количества реакции.

Компоненты продукции

инструкция по эксплуатации

Безклеточный синтетический набор белков (Cell - Free Protein Synthesis Kit).Продукты синтеза белков in vitro на основе клеточного крекинга кишечной палочки. Данный продукт используетсярибосомы, факторы перевода, ферменты и другие активные вещества в клеточном крекинговом растворе с добавлением энергии,Нуклеотиды, аминокислоты, неорганические соли и т. Д. Реконструкция транскрипции in vitro- Система перевода. ДНК илиРНК является шаблоном, который выражает белки. Безклеточная экспрессия - это не зависящая от живых бактерий,Способность быстро и гибко выражать белки в больших количествах по сравнению с традиционными рекомбинантными системами экспрессииМногочисленные преимущества:

1. Белки экспрессируются быстро, 1 - 2 h может выразить целевой белок, 8 - 24 h может достичь максимумаМного.

Высокая экспрессия белка, максимальный гао может достигать белка более 3 мг / мл.

Реакция простая и гибкая, просто добавьте шаблон ДНК или РНК в реакционную систему, можетиспользовать96 - пористая пластина или центрифуга реагируют.

Примечание: Данный продукт товарного знака может выражать обычные белки, более подходящие для экспрессии белков, содержащих дисульфидные связи.

область применения

Продукт Jin ограничен научными исследованиями специалистов, не может использоваться для клинической диагностики или лечения, не может использоваться для продуктов питания или лекарств.

инструкция по эксплуатации

1. Генетическое строительство

Построение гена назначения имеет решающее значение для экспрессии белка, и рекомендуется использовать способ построения, показанный ниже. Ген цели может быть построен на положительных плазмидах, прилагаемых к этому набору реагентов (карта плазмиды подробно описана в двухмерном коде сканирования на этикетке внешней упаковки), то есть следующим образом построения; Также совместимы с pET9a, pET - 23a и другими протонами серии PET, содержащими T7 - инициатор, но не лактозный оператор (lac).

Примечание: Протеины, содержащие лактодоны (например, pET28a и т.д.), оказывают большое влияние на урожайность и не рекомендуются для прямого использования.

Вот схема последовательности ДНК положительных плазмидов.А.

2. Подготовка шаблонов

Безклеточный синтетический набор белков может использовать ДНК или мРНК в качестве шаблона для выражения рекомбинантных белков. Используемый шаблон ДНК может быть плазмидом, продуктом PCR или продуктом расширения кольца RCA с помощью phi29.

2.1 плазмиды:: Получение плазмиды, пригодной для бесклеточных реакций, путем синтеза генетическими компаниями или субклонирования, и извлечение плазмиды методом стержневой очистки;

2.2 Продукты PCR:: Конструкция экстракта, положительного экстракта в верхнем течении инициирующего подкласса T7 около 200 bp, обратного экстракта в нижнем течении инициирующего кодона около 200 bp (включая Терминатор T7), расширение шаблона, полученный линейный фрагмент ДНК может быть непосредственно введен в систему без очистки. Функция основания 200 bp в верхнем и нижнем течении заключается в защите линейных сегментов ДНК от деградации эндогенными экзогенными ферментами.

2.3 Продукты RCAВ RCA с использованием полимеразы phi29, случайных шести экстрактов, полученные продукты ДНК могут быть использованы непосредственно в системах без клеточных реакций.

2.4 PCR и RCA могут быть объединены с Golden Gate и Gibson Assembly, что значительно увеличит скорость и поток подготовки шаблонов ДНК.

2.5Перед использованием шаблонов ДНК требуется точная количественная оценка; Рекомендуется использовать высококачественные наборы для экстракции плазмиды, чтобы избежать введения Rnase A; Компании по генному синтезу возвращают плазмиды, которые должны быть очищены с помощью колонн, иначе они не могут быть использованы непосредственно для бесклеточных реакций.

3. Бесклеточная экспрессия белков

3.1Жидкость А и В, необходимая для расчета общего объема реактивной системы (отношение объема 1: 2), добавляется на лед в реактивный контейнер (например, центрифуга с круглым дном 2 мл) и смешивается. Операция требует ношения перчаток, масок на протяжении всего процесса, а также использования абсорбирующих головок и реактивных контейнеров для переносчиков без ферментативного источника, чтобы избежать введения нуклеаза.

Система без клеточной реакции может быть смешана со следующей таблицей:

3.2Добавление шаблонной ДНК в реакционную систему, рекомендуемая конечная концентрация добавления шаблона ДНК составляет от 5 до 10 мкг / мл, что оптимизирует добавление шаблона ДНК.

3.3Реакционный контейнер помещается в обычный качающийся станок или термостат для экспрессии белка без клеток, рекомендованная температура реакции от 25 до 30°C. Снижение температуры снижает скорость синтеза белков, но повышает их растворимость. Как правило, реакция около 8 ч может достигать максимальной выработки белка, а также может реагировать на 16 ч в течение ночи. Когда температура реакции снижается, время реакции должно быть соответствующим образом увеличено.

3.4Для экспрессии безклеточного белка требуется достаточное количество кислорода, и при использовании 2 - миллиметровой центрифуги с круглым дном в качестве реактивного сосуда реакционная система не превышает 100 мкл. Безклеточные белковые реакции могут быть увеличены в равных пропорциях, а усиленные реакционные системы должны использовать более крупные реактивные сосуды, такие как встряхивающие бутылки и т. Д. При этом гарантируя скорость вращения качающегося станка (200 rpm).

4. Обнаружение

В конце реакции берется реактивная жидкость (для обнаружения всего белка) или реакция на очищение (для обнаружения растворимого белка) около 1 мкл, проводится электрофорез белкового геля SDS - PAGE для обнаружения экспрессии белка назначения.

5. Положительный контраст

В этом наборе в качестве положительного контраста присутствуют плазмиды зеленого флуоресцентного белка sf - GFP, результаты которых можно наблюдать непосредственно невооруженным глазом. После успешной экспрессии sf - GFP система без клеточной реакции будет иметь ярко выраженный зеленый цвет.

Для точной количественной оценки sf - GFP можно использовать маркер фермента (Ex / EM = 485 / 528 нм).