Быстрый один шаг клонирования комплект

Условия хранения и транспортировки:-20℃

Состав продукции:Быстрый один шаг клонирования комплект

Описание продукта

Быстрый один шаг клонирования комплект

Технология бесшовного клонирования, основанная на принципе рекомбинации, как метод клонирования нового поколения, не зависит от громоздких ферментативных срезов, шагов соединения и не требует конечной операции выравнивания, в соответствии с реорганизацией гомологической последовательности 15 - 25 НТ в конце фрагмента ДНК и линейного носителя, вставленный фрагмент может быть клонирован в любую точку произвольного линейного носителя с очень низким фоном автономности носителя, это простая, быстрая и эффективная технология направленного клонирования ДНК.

Быстрый один шаг клонирования комплектБесшовный набор клонированных реагентов, одна реакция может завершить рекомбинацию от одного до нескольких фрагментов ДНК, до пяти минут, чтобы завершить однофрагментарную рекомбинацию, и более 95% положительных результатов. Дополнительные факторы, добавленные в Kit, эффективно повышают положительную частоту клонирования; Оптимизированная реакционная система может в определенной степени переносить примеси, содержащиеся в неочищенных продуктах PCR. Обновленная версия бесперебойного клонирования имеет более высокую положительную реакцию и лучшую совместимость.

Экспериментальные шаги

1. Краткое описание экспериментального процесса

2. Подготовка линейных клонированных носителей

Выберите подходящий участок клонирования для линейности носителя, который может быть выполнен с помощью ферментативного сдвига или обратного расширения PCR.

Ферментная подготовка.

Некоторые ограничивающие эндокринные ферменты не могут эффективно переваривать сверхспиральную ДНК, поэтому они могут оставлять различные количества неразрезанной векторной ДНК, снижая положительную частоту. Рекомендуется использовать LightNingTM Rapid Nacheraza для ферментативной резки (моноферментная или биэнзимная резка), чтобы сделать носитель линейным, чтобы уменьшить трансформирующий фон (ложноположительное клонирование, полученное в результате преобразования неразрезанного носителя).

ПРИМЕЧАНИЕ 1: Линейные носители, подвергшиеся ферментативному резанию, не нуждаются в дефосфатировании, и рекомендуется использовать биферментный срез.

Примечание 2: После завершения ферментативного разреза рекомендуется использовать эндотерапию после инактивации или очистки целевого продукта для рекомбинантной реакции.

Обратная подготовка PCR

Чтобы уменьшить введение амплифицированных мутаций, рекомендуется использовать высоконадежный PCR Mix для амплификации. Рекомендуется использовать предварительно линейные плазмиды в качестве шаблонов для уменьшения воздействия остатков кольцевых плазмидных шаблонов на положительную частоту клонирования.

Примечание 1: Если продукт PCR не является специфической полосой, рекомендуется использовать шаблон пищеварительной плазмиды Template Eliminator (товарный номер: EG21203) для рекомбинантных реакций; Вместо этого рекомендуется использовать продукт PCR после очистки.

Примечание 2: При многокомпонентном клонировании рекомендуется использовать продукт PCR после очистки.

3. Конструкция вставленных фрагментов PCR - экстракта

5 'конец цитаты PCR должен содержать последовательность от 15 до 25 nt (рекомендуется 18 nt), гомологичную в конце соседнего фрагмента (вставленного фрагмента или носителя). Если носитель является вязким концом, а 3 'конец выделяется, то конструкция экстракта должна содержать выступающую часть; Если торцевая выпуклость 5 ', то конструкция экстракта может содержать выступающую часть или не включать ее.

Вставить фрагмент с прямым расширением:

5 'Конечная гомологическая последовательность верхнего носителя + точка сдвига фермента (необязательно) + генотипическая последовательность положительного усиления 3'

Вставить фрагмент с обратным расширением:

3 'Генетически специфичная обратная амплификационная последовательность + ферментный срез (необязательно) + конечная гомологическая последовательность 5'

Примечание 1: насколько это возможно, для клонирования выбирается область без повторяющихся последовательностей и с равномерным содержанием GC, рекомбинация высока, когда содержание GC составляет от 40% до 60% в зоне 25 nt вверх и вниз по течению от места клонирования носителя;

Примечание 2: В этом наборе представлена следующая последовательность соединений носителя pUC 19 (Ampr):

4. Расширение PCR при вставке фрагментов

Рекомендуется использовать высоконадежный PCR Mix для расширения, чтобы уменьшить введение амплифицированных мутаций. Рекомендуется использовать очищенный продукт PCR для бесперебойного клонирования, который может быть использован непосредственно, если продукт PCR идентифицирован как специфический продукт амплификации электрофорезом агаринового геля, но объем образца не должен превышать 20% от общего объема реакции.

5. Реакция на реорганизацию

В ледяной ванне устанавливается следующая система реакции:

a. Оптимальное использование носителя (g) = 0,02 × логарифм оснований носителя, т.е. 0,03 pmol.

b. Вставить один фрагмент, оптимальное использование фрагмента (g) = 0,04×фрагмент логарифма оснований; Вставьте несколько фрагментов, каждый фрагмент zui применимое количество (ng) = 0,02 × фрагмент логарифм оснований.

Примечание 1: Если длина вставленного фрагмента превышает длину носителя, то носитель должен быть заменен количеством вставленного фрагмента;

Примечание 2: Если длина вставленного фрагмента меньше 200 bp, то вставленный фрагмент должен быть использован в 5 раз больше носителя;

Примечание 3: Если количество, рассчитанное по вышеуказанной формуле, превышает/ Максимальное значение, рекомендуется непосредственно нажатьЗуи/ Максимальное использование;

ПРИМЕЧАНИЕ 4: Части носителя являются слишком длинными, вставленные фрагменты слишком длинными или слишком много фрагментов, и коэффициент положительного клонирования снижается.

После завершения компиляции системы рекомбинантной реакции, используйте капсульную пушку, чтобы мягко всасывать и смешивать компоненты, чтобы избежать образования пузырьков, не вихрей.

2) Поместите реакционную систему при температуре 50°C и отреагируйте от 5 до 60 мин.

Примечание 1: Рекомендуется использовать более точные приборы с температурным контролем, такие как PCR, что снижает эффективность клонирования при недостаточном времени реакции или слишком длительном времени;

Примечание 2: При вставке 1 - 2 фрагментов рекомендуемое время реакции составляет 5 - 15 мин. При вставке 3 - 5 фрагментов рекомендуемое время реакции составляет 15 - 30 мин.

Примечание 3 При наличии скелета носителя более 10 кб или вставленного фрагмента более 4 кб рекомендуется увеличить время реакции до 30 - 60 мин.

Примечание 4: После завершения реакции при температуре 50°C рекомендуется мгновенная центрифуга для сбора реакционной жидкости до дна трубы.

Центробежные трубы реактивной жидкости помещаются на лед для охлаждения, а затем преобразуются или хранятся при температуре 20°C.

Примечание 1: Храненные продукты рекомбинации при 20°C рекомендуется использовать в течение 1 недели.

6. Преобразование продуктов реорганизации

Возьмите 5 - 10 мкл реактивной жидкости, добавьте 100 мкл чувственных клеток, медленно всасывайте и смешивайте, помещайте на лед в течение 30 минут. 42 °C тепловое возбуждение 45 ~ 60 sec, ледяная ванна 5 мин. Добавьте 500 мкл SOC или LB питательной среды, 37 °C колебательной культуры 40 - 60 мин (200 rpm). Бактериальный раствор равномерно наносится на планшет, содержащий соответствующие антибиотики, и переносится на ночную культуру при температуре 37°C.

Примечание 1: Последняя положительная реакция на клонирование будет варьироваться в зависимости от рецепторных клеток, и рекомендуется использовать преобразовательную эффективность > 108 CFU / мкг чувственных клеток;

Примечание 2 Количество колоний зависит от количества и чистоты продуктов PCR и линейных носителей;

Примечание 3: Положительные контрольные пластины обычно выращивают большое количество белых моноколоний, в то время как отрицательные контрольные пластины выращивают очень мало колоний.

7. Положительный тест на клонирование

Выберите одиночную колонию до 10 мкл ddH2O, чтобы перемешаться, после крекинга 95°C 10 мин, возьмите 1 мкл крекинга в качестве шаблона, проверьте колонию PCR или введите одиночную колонию в резистентную среду для культивирования в течение ночи, чтобы извлечь плазмиды для ферментативной идентификации.

Положительный тест на клонирование, цитометрический экстракт PCR с использованием универсального экстракта M13F и M13R, энзимная резекция с использованием HindIII и EcoRI.

Примечание 1: При колонизации PCR рекомендуется использовать по крайней мере один универсальный экстракт, чтобы избежать ложноположительных результатов;

Примечание 2 - При необходимости могут быть проведены дополнительные секвенирования положительных результатов.

注3： M13F: TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R: CAGGAAACAGCTATGAC

Американская компания Azaood, основанная в 2004 году, является отраслевым Lingdao разработчиком и производителем высококачественных очищающих ферментов, белков, наборов для нуклеиновой кислоты и клеточного разделения, а также сывороток для коров - потомков для исследований в области наук о жизни, диагностики и биотехнологии. Компания Azood является ведущим производителем, сертифицированным по стандарту ISO9001 и отвечающим требованиям, предъявляемым к приложениям и требованиям от исследований до крупномасштабной биообработки и OEM.