Дегидрогеназа пировиноградной кислоты

Дегидрогеназа (ПДХИнструкция по набору для обнаружения активности Микрометод

Примечание: Реактор данного продукта изменен, обратите внимание и действуйте строго в соответствии с этой инструкцией.

Номер груза:БЦ0385

спецификация100T/96S

Состав продукта: Перед использованием тщательно проверьте, соответствует ли объем реагента объему внутри бутылки, пожалуйста, свяжитесь с персоналом Solebal вовремя.

Дегидрогеназа пировиноградной кислоты

Дегидрогеназа пировиноградной кислоты

Составление раствора:

1. Реактор IIА.Для легкоиспаряющегося реагента запечатывайте его как можно скорее после окончания,-20℃Сохранить.

2. Приготовление рабочей жидкости: перед использованием5,75 млРеактор 4, реагент 5,0,45 млРеактор 6,1,75 млРеактор 7 переносится в бутылку реагента 3.(Всего15.45мл, Ио85T)Неоконченные реагенты-20℃Хранить раздельно, можно сохранить4Неделя.Избегайте повторного замораживания.

Описание продукции:

ПДХ(EC 4.1.1.1Широко распространен в животных, растениях, микроорганизмах и культивируемых клетках, представляет собой комплекс дегидрогеназы пировиноградной кислоты.(PDHC)Ограничивающий скорость фермент, катализирующий окисление и декарбоксилирование пировиноградной кислотыСоедините гликолиз с циклом трикарбоновых кислот.

ПДХКаталитическая дегидрогенизация пировиноградной кислоты при одновременном восстановлении2,6 -Дихлорфенол индигол (2,6-ДКПИП), что приводит к605 нмУменьшение поглощения света.

Пирувиновая кислота + Тиамин Пирофосфат Гидроксиэтил Тиамин Пирофосфат

Дихлорфенолиндофенол (605нм) + гидроксиэтил тиамин пирофосфат уменьшенный дихлорфенолиндофенол

Примечание: Перед экспериментом рекомендуется выбрать2 - 3Для проведения предварительных экспериментов были отобраны образцы с большой разницей в ожиданиях. Если значения поглощения проб не входят в диапазон измерений рекомендуется разбавить или увеличить количество проб для проверки.

Требуется оборудование и принадлежности:

видимый спектрофотометр/Ферментный маркер, водяная ванна, настольная центрифуга, регулируемый переносчик жидкости, микростеклянная чашка/ 96Дырка, ступа/Амортизаторы, лед и дистиллированная вода.

Шаги действия:

I. СОДЕРЖАНИЕОбработка образцов(Количество выборки, подлежащей измерению, может быть соответствующим образом скорректировано, конкретные пропорции могут быть указаны в литературе)

1. Организация: Назовите договор0.1gОрганизация, присоединение1 млРеактор I и10 мклРеактор II, полностью измельченный с помощью равномерного раствора для ледяной ванны или ступни,4 ℃ 11000гЦентрифугирование10 минутВзять и очистить,Оставайтесь на льду.Измерения.

2. Клеточные или бактериальные образцы: сначала соберите500Десять тысяч клеток или бактерий в центрифужную трубку, после центрифугирования выбрасываются; После присоединения1млРеактор I и10 мклРеактор IIЛедяная ванна ультразвуковое дробление бактерий (мощность200 WУЗИ, УЗИ3 секундыИнтервал,7 секундОбщее время5 минут); затем11000g，4°C, центрифуга10 минут，

Вытащите их на лед для проверки.

3. Сыворотка (плазма)И другие образцы жидкостей.: Прямое тестирование.Если раствор мутный, он центрифужно очищается для определения.

II. Этапы измерения

1.ВидимыйПодогрев спектрофотометра или энзимометра30 минутВыше, регулируйте длину волны до605 нмСпектрофотометр дистиллирует воду на ноль.

2.Каждая выборка требует180мклРабочая жидкость,В соответствии с требованиями экспериментаВынимаем определенное количество рабочей жидкости37℃(Млекопитающие) или25℃(Другие виды)В водяной ванне.Водная баня10 минутА.

3.Пустая трубка: в микрометрической чашке или96Добавить в Конг180мклРабочие жидкости и10 мклВода, смешивание, немедленная запись605 нмместо10sместовеличина поглощенияА1и1мин10sПоследующие значения поглощенияА2Расчет,ΔАпустота= А1-А2А.Пустую трубку нужно только измерить.1 - 2разА.

4.Измерительная трубка: в микропропорциональной чашке Петри или96Добавить в Конг180мклРабочие жидкости и10 мклОбразец, перемешивание, немедленная запись605 нмместо10sместовеличина поглощенияА3и1мин10sПоследующие значения поглощенияА4Расчет,ΔАопределение= А3-А4А.

III.ПДХРасчет активности

а.Формула расчета, измеренная микроскопическим цветом, выглядит следующим образом:

1. По концентрации белка в выборке.

Определение единицы: каждыймгСтруктурные белки потребляются в реакционной системе каждую минуту.1нмоль 2,6-Дихлорфенол индигофенол определяется как ферментно - активная единица.

ПДХАктивность (U/мг прот)=[(ΔА)определение-ΔАпустота) Цуй(ε×d)× ВКонтр - генеральныйх 10⁹]÷(Cpr×V)А÷Т

= 904,762×(ΔА)определение-ΔАпустота÷Cpr

2. По качеству выборки

Определение единицы: каждыйgОрганизация расходует каждую минуту в реакционной системе.1нмоль 2,6-Дихлорфенол индигофенол определяется как ферментно - активная единица.

ПДХАктивность (U/гКачество)=[(ΔА)определение-ΔАпустота) Цуй(ε×d)× ВКонтр - генеральныйх 10⁹]÷(В)АВТип в целом×Ш) ÷Т

= 913,81×(ΔА)определение-ΔАпустота÷W

3. По количеству бактерий или клеток.

Определение единицы: каждый1Миллионы бактерий или клеток потребляют каждую минуту в реакционной системе1нмоль 2,6-Дихлорфенол индигофенол определяется как ферментно - активная единица.

ПДХАктивность (U/10⁴клетка)=[(ΔА)определение-ΔАпустота)×ВКонтр - генеральныйЧжи(ε×d)х 10⁹]÷(В)АВТип в целом× 500)÷Т

= 1,828×(ΔА)определение-ΔАпустота)

4. По объему выборки

Определение единицы: каждыймлжидкостьВ реакционной системеПотребление в минуту1нмоль 2,6-Дихлорфенол индигофенол определяется как ферментно - активная единица.

ПДХАктивность(U/мл)=[(ΔА)определение-ΔАпустота)×ВКонтр - генеральный÷(ε×d)×10⁹]÷VА÷Т

= 904,762×(ΔА)определение-ΔАпустота)

VАнтиагрегация: общий объем реакционной системы,1.9×10^-4L*εА.2,6 -коэффициент мольной экстинкции дихлориндол - фенола,2.1×10⁴л/моль/см*d: Световой диаметр чашки Петри,1 см*VОбразец: Добавить объем выборки,0,01 мл*VОбразец в целом: добавьте реагент I и реагент II объема,1,01 мл*T: Время реакции,1 минута*КПР:: концентрация белка в выборке,мг/мл*W: Качество выборки,g*500: Общее количество бактерий или клеток,500млн долл США.

b.использовать96Расчетная формула, измеренная диафрагмой, выглядит следующим образом.

1.По концентрации белка в выборке.

Определение единицы: каждыймгСтруктурные белки потребляются в реакционной системе каждую минуту.1нмоль 2,6-Дихлорфенол индигофенол определяется как ферментно - активная единица.

ПДХАктивность (U/мг прот)=[(ΔА)определение-ΔАпустота)×ВКонтр - генеральныйЧжи(ε×d)х 10⁹]÷(Cpr×V)А÷Т

= 1809.524×(ΔА)определение-ΔАпустота÷Cpr

2.По качеству выборки

Определение единицы: каждыйgОрганизация расходует каждую минуту в реакционной системе.1нмоль 2,6-Дихлорфенол индигофенол определяется как ферментно - активная единица.

ПДХАктивность (U/гКачество)=[(ΔА)определение-ΔАпустота)×ВКонтр - генеральныйЧжи(ε×d)х 10⁹]÷(В)АВТип в целом×Ш) ÷Т

= 1827,62×(ΔА)определение-ΔАпустота÷W

3.По количеству бактерий или клеток.

Определение единицы: каждый1Миллионы бактерий или клеток потребляют каждую минуту в реакционной системе1нмоль 2,6-Дихлорфенол индигофенол определяется как ферментно - активная единица.

ПДХАктивность (U/10⁴клетка)=[(ΔА)определение-ΔАпустота)×ВКонтр - генеральныйЧжи(ε×d)х 10⁹]÷(В)АВТип в целом× 500) ÷Т

= 3,655×(ΔА)определение-ΔАпустота)

4.По объему выборки

Определение единицы: каждыймлжидкостьВ реакционной системеПотребление в минуту1нмоль 2,6-Дихлорфенол индигофенол определяется как ферментно - активная единица.

ПДХАктивность(U/мл)=[(ΔА)определение-ΔАпустота)×ВКонтр - генеральный÷(ε×d)×10⁹]÷VА÷Т

= 1809.524×(ΔА)определение-ΔАпустота)

VАнтиагрегация: общий объем реакционной системы,1.9×10^-4L*εА.2,6 -коэффициент мольной экстинкции дихлориндол - фенола,2.1×10⁴л/моль/см*dА.96диаметр диаметра диска,0,5 см*VОбразец: Добавить объем выборки,0,01 мл*VОбразец в целом: добавьте реагент I и реагент II объема,1,01 мл*T: Время реакции,1 минута*КПР:: концентрация белка в выборке,мг/мл*W: Качество выборки,g*500: Общее количество бактерий или клеток,500млн долл США.

Внимание:

1.Все образцы были размещены на льду и2Тестирование в течение часа, чтобы избежать дегенерации и инактивации.

2.измерительныйΔАЗначение0.01 - 0.25Между, если измерить трубкуΔАЗначение больше0.25Необходимо разбавить образец.Умножение в формуле на разжижение.Если измерить трубкуΔАзначениемаленькийЮй0.01Необходимо увеличить количество выборки после повторного измерения, обратите внимание на синхронное изменение формулы расчета.

3.Поскольку реагент 1 содержит определенную концентрацию белка (1 мг/млПоэтому при определении концентрации белка в образце необходимо вычестьРеактор 1Содержание белка.

Примеры экспериментов:

1.取0.1gПечень мышиприсоединиться1 млРеактор I и10 мклРеактор II, полностью измельченный с помощью равномерного раствора для ледяной ванны или ступни,4℃А11000gЦентрифугирование10 минутВозьмите очищенный лед, действуйте в соответствии с измеренными шагами, используйтеНебольшая кварцевая чашкаизмеритьвычислениеΔАопределение=A3-A4=1.3106-1.1183=0.1923А,ΔАпустота=A1-A2 =1.3325-1.3314=0.0011По массе выборки рассчитывается, что фермент жив:

ПДХАктивность(U/г)качество= 913,81×(ΔА)определение-ΔАпустота÷W=1747 U/gКачество.

Соответствующие публикации:

[1]Peng S, Wang Y, Zhou Y, et al. Редкие гинсенозиды улучшают резистентность миокарда к инсулину, вызванную липидной перегрузкой, посредством модулирования метаболической гибкости [J]. Фитомедицина, 2019, 58: 152745.

Ссылки:

[1]Guitart M, Andreu A L, García-Arumi E, et al. FATP1 локализируется в митохондриях и повышает активность пируватной дегидрогеназы в скелетных миотрубках [J]. Митохондрия, 2009, 9(4): 266-272.

Соответствующая серия продуктов:

BC0710/BC0715 альфа-Дегидрогеназа (α-КГДХНабор для анализа активности

BC2150/BC2155Лимонная кислота (CAНабор для определения содержания

BC0950/BC0955Дегидрогеназы янтарной кислоты (SDHНабор для анализа активности