Скачать One Step Gibson Cloning Kit

Один шаг Gibson Cloning Kit

(Можно подключить 1 - 5 фрагментов)

Скачать One Step Gibson Cloning Kit

Номер каталога:42112

Упаковка:

Хранение продукции:-20БCСохранить, чтобы избежать повторного замораживания

Описание продукта: данный продукт не зависитТ4Ассоциированные ферменты, которые не ограничены точками сдвига ферментов носителя и сегмента цели, а непосредственно рекомбинантными методами перекрывающихся сегментов, с помощью специальной комбинации ферментов могут линейно использовать любой метод после носителя и его обоих концов15-25bpперекрывающийсяПЦРФрагмент (плоский конец) направленная реорганизация, которая может быть реализована быстро1 - 5Эффективное и бесшовное клонирование фрагментов.

Характеристики продукта:

1. 30Одна или несколько минут могут быть длинными и короткими.ПЦРРасширенный фрагмент (плоский конец) вставляется в носитель.

2. Наличие свободных от носителя и вставленных фрагментарных ферментов участков и плоских концов носителя/Ограничение вязкого конца может быть клонировано в любой точке.

3.Бесшовное клонирование, точка вставки не вводит ненужные последовательности оснований.

4.Эффективный, точный, положительный коэффициент >95%А.

Подготовка линейных носителей и вставленных фрагментов ДНК:

A: Подготовка линейных носителей

(1) Источники ферментации:Линейный носитель, полученный в результате ферментативного сдвига, плоский конец или липкий конец, моноферментный сдвиг или биферментный сдвиг могут быть восстановлены после ферментативного сдвига клея.

Примечание: В системе бесшовного сращивания и клонирования нет двухцепочечных ДНК - соединительных ферментов, и не происходит автоцепной реакции носителя. Таким образом, даже линейные носители, подготовленные с помощью моноферментативного сдвига, не требуют конечной дефосфатизации. Ложно - положительные клоны (без вставки фрагментов), возникающие после преобразования рекомбинантного продукта, образуются путем преобразования полностью нелинейного кольцевого вектора фермента Чевана. Мы рекомендуем, чтобы рекуперация клея после ферментативного разреза снизила долю этого нелинейного носителя до низкого уровня zui.

(2) Обратный источник PCR:Рекомендуется использовать высококачественную ДНК - полимеразу (грузовой номер: P517 - 05) для подготовки, если полоса усиления одинакова, носитель может быть получен путем очистки продуктов PCR (грузовой номер: DC012 - 100), в противном случае носитель может быть получен путем рекуперации клея (грузовой номер: DC011 - 100).

Примечание: Обратный PCR - протоплазмидный шаблон также является нелинейным носителем и может также привести к ложноположительному клонированию (без вставленных фрагментов), поэтому линейный носитель источника PCR (продукт PCR) перед очисткой переваривает протоплазмидный шаблон с помощью Dpn I - эндокринозы, которая может уменьшить фон и увеличить положительную скорость. Но, как правило, рекуперации клея достаточно, чтобы уменьшить долю этого нелинейного носителя до низкого уровня Zui, поэтому мы также рекомендуем рекуперацию клея для линейного носителя обратного источника PCR.

B: Подготовка вставленных фрагментов ДНК

(1) Конструкция отдельных вставленных фрагментов клонированных экстрактов: клонированные экстракты включают в себя вставленные фрагментарные специфичные последовательности экстрактов и перекрывающиеся последовательности.

Клонированная прямая кавычка (5 '- 3'): линейный носитель с прямой последовательностью перекрывающихся областей 16 - 25 nt (от 3 'конца) + вставка фрагмента с положительной специфичной последовательностью кавычек (18 - 25 nt)

Клонированные обратные кавычки (5 '- 3'): последовательность перекрывающихся областей с обратным 16 - 25 nt на линейном носителе (начиная с конца 3 ') + вставленные фрагменты с обратной специфичностью кавычек (18 - 25 nt)

Внимание:Базовое число щелочи в перекрывающейся области должно быть не менее 16 bp, а значение Тм между несколькими перекрывающимися областями должно быть согласовано и > 60°C (AT pair = 2°C и GC pair = 4°C), в противном случае количество оснований может быть увеличено до тех пор, пока оно не будет соответствовать требованиям.

В соответствии со структурой конца линейного носителя (5 'выступ, 3' выступ, плоский конец), конструкция экстракта также разделена на три случая.

Оба конца линейного носителя различаются линейными способами (например, моноферментная, биферментная, обратная PCR) и могут быть двумя или двумя произвольными комбинациями вышеуказанных трех конечных структур. Принципы специальной конструкции экстракта для вставки фрагментов соответствуют принципам общей конструкции экстракта.

При расчете температуры отжига амплифицированного экстракта необходимо только вычислить значение Тм специфической последовательности амплификации гена, а конечная гомологическая последовательность носителя не должна участвовать в вычислении.

В соответствии с вышеуказанными принципами проектирования, начиная с конца 3, обратный отсчет 16bp - 25bp (в этом примере используется та же последовательность, которая перекрывается концом 20 bp) может быть добавлен к предыдущему специфичному последовательности экстрактов целевого фрагмента. Удостоверьтесь, что значения Тм в перекрывающейся области совпадают и > 60°C (AT pair = 2°C и GC pair = 4°C).

Прямые экстракты: 5 'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGНННННННННННН 3'

Примечание: после того, как вышеупомянутая конструкция экстракта завершит клонирование соединения, точка сдвига EcoR I - фермента исчезнет (без сохранения точки сдвига фермента).

Если необходимо сохранить EcoR I - энзимные точки, требующие восполнения недостающей последовательности EcoR I - идентификаторов aattc между перекрывающейся последовательностью 20 bp в конце носителя и специфической последовательностью экстрактов фрагмента назначения,После завершения клонированного соединения остаются участки ферментативного среза EcoR I (зарезервированные участки ферментативного среза).

Конкретно: 5 'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCG aattc NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

носитель разрезается ферментом Hind III, образуя 5 'выступающий конец:

В соответствии с вышеуказанными принципами проектирования, начиная с конца 3, обратный отсчет 16bp - 25bp (в этом примере используется та же последовательность, которая перекрывается концом 20 bp) может быть добавлен к предыдущему специфичному последовательности экстрактов целевого фрагмента. Удостоверьтесь, что значения Тм в перекрывающейся области совпадают и > 60°C (AT pair = 2°C и GC pair = 4°C).

Обратный экстракт: 5 'CTGCCATCGGATCGTTCGCAНННННННННННН 3'

Примечание: после того, как вышеупомянутая конструкция экстракта завершит клонирование соединения, точка сдвига Hind III исчезнет (без сохранения точки сдвига фермента).

Если необходимо сохранить Хинд III - энзимный сдвиг, требующий восполнения недостающей последовательности идентификаторов Hind III между перекрывающейся последовательностью 20 bp в конце носителя и специфичной последовательностью экстрактов фрагмента назначения agctt ，Позиции ферментативного среза Hind III все еще существуют (зарезервированные участки ферментативного среза).

Конкретно: 5 'CTGCCATCGGATCGTTCGCA agctt NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

(2) Клонирование нескольких вставленных фрагментов: метод проектирования вставленных фрагментов с двумя концами носителя

* Область перекрытия между несколькими вставленными фрагментами спроектирована таким образом, чтобы иметь два вышеуказанных способа * маркировки (синий и красный), и при проектировании многокомпонентных экстрактов выбор любого из них или обоих способов смешивания может гарантировать, что между фрагментами и фрагментами есть область перекрытия 15 - 25 bp.

(3) Выбор ферментов: Рекомендуется использование высокоточной ДНК - полимеразы или PCR Mix (товарные номера: P517 - 05 или P814 - 05).

(4) Условия реакции: как правило, в соответствии с инструкцией по использованию полимеразы.

(5) Очистить вставку

lМожно выбрать:Если фрагмент происходит от протоплазмидного шаблона, и плазмида имеет ту же устойчивость, что и рекомбинантный носитель, то перед очисткой протоплазмидный шаблон переваривается с помощью эндокринозы Dpn I, что снижает фон и повышает положительную частоту.

lЕсли фрагмент единичный, рекомендуется очищать фрагмент с помощью упаковки реагента для очистки продуктов PCR (номер груза: 43012–100).

лВ случае неспецифического усиления рекомендуется рекуперировать фрагменты с помощью резинового комплекта для рекуперации реагентов (товарный номер: 43011–100).

лИспользуя этот метод клонирования, точки ферментативного сдвига, используемые для линейного носителя, будут отсутствовать при соединении, и если есть строгие требования к точкам сдвига фермента, рекомендуется Обратите внимание на выбор места ферментативного сдвига, если это необходимо.Между перекрывающимися областями и специфическими генетическими последовательностямиДобавление недостающих оснований для восстановления изначальных точек ферментативного сдвига (см. приведенные выше примеры положительной и обратной конструкции экстракта).

лЕсли рекомбинантные плазмиды используются для экспрессии белка, обратите внимание на рамки чтения кода при проектировании экстракта, последовательности, необходимые для экспрессии и очистки белка (например, инициирующие частицы, последовательности RBS, инициирующие кодоны, заканчивающие криптоны, белковые метки и т. Д.), не будут повреждены.

Операционные этапы бесшовной реакции клонирования:

Примечание: 2xCloning Master Mix содержит усилитель соединения PEG очень вязкий, вытаскивается из холодильника при низкой температуре, может быть помещен в ладонь, чтобы заморозить несколько минут, чтобы повысить температуру, чтобы уменьшить вязкость (без ущерба для качества), пальцыБо полностью перемешивает дно центробежной трубки или вихревое сотрясение.

1. Построение реакционной системы в соответствии со следующей таблицей (может быть изготовлено при комнатной температуре с помощью трубки PCR)

* Носители обычно используют 10 - 50 нг, вставляя фрагменты с Морби носителя между 2: 1 - 3: 1; Если вставленный фрагмент меньше 200bp, вставленный фрагмент и носитель Morbi 5: 1, в случае многофрагментного соединения, отношение мор между фрагментом и фрагментом составляет 1: 1.

2. Слегка смешать, в 50БРеакция C длится 15 минут (может быть выполнена на приборе PCR), после чего трубка PCR после установки на лед преобразуется или сохраняется непосредственно в - 20.БC. Соединение более 3 сегментов может продлить время реакции до 30 минут.

3. Возьмите 5 мкл реакционного продукта для преобразования в соответствии с инструкцией по сенсорным клеткам (если преобразователей меньше, все продукты могут быть преобразованы и все конверсионные жидкости покрыты пластинами).

Идентификация положительного клонирования:

В зависимости от конкретного случая, можно выбрать колонию для PCR - идентификации, экстракции плазмиды (товарный номер 31011 - 100) для ограничительной эндокринной идентификации или секвенирования.

Скачать One Step Gibson Cloning Kit