Скачать One Step Seamless Cloning Kit

Один шаг безшовный набор клонирования (Один фрагмент)

Скачать One Step Seamless Cloning Kit

Номер каталога:42111

Упаковка:

Хранение продукции:-20БC Сохранить, чтобы избежать многократного замораживания

Описание продукции:Одноступенчатый бесшовный клонированный набор реагентов не зависит от T4 - коннектазы, не ограничен точками сдвига фермента носителя и целевого сегмента, а непосредственно с помощью метода рекомбинации перекрывающихся сегментов, с помощью специальной комбинации ферментов можно линейно соединить любой метод с направленным рекомбинантным соединением носителя и фрагмента PCR с перекрывающимися областями 16 - 25bp на обоих концах, что позволяет эффективно направлять и бесшовно клонировать фрагменты продуктов PCR на конце A или плоском конце в любую точку носителя в течение 30 минут.

Характеристики продукта:

1. В течение 30 минут в любое место любого носителя можно вставить клонированный фрагмент с расширением 50bp - 15kb PCR (плоский / A конец).

2. Клонирование может быть произведено в любой точке без ограничений на наличие носителя и вставленного фрагментарного энзимного сечения на мирных / вязких концах.

3. Бесшовное клонирование, точка вставки не вводит ненужные последовательности оснований.

4. Не полагаясь на соединительные ферменты и фосфатазы, высокоэффективный, точный, клонированный положительный коэффициент может достигать более 95%.

Схема принципа одноступенчатого бесшовного клонирования наборов реагентов:

Подготовка линейных носителей и вставленных фрагментов ДНК:

A: Подготовка линейных носителей

(1) Источник ферментативного срезания: линейный носитель, полученный ферментным срезом, плоский конец или липкий конец, моноферментный срез или биферментный срез могут быть восстановлены после ферментативного среза клея.

Примечание: В одноступенчатой системе бесперебойного клонирования нет двухцепочечной ДНК - соединительной фермента, и не происходит автоцепной реакции носителя. Таким образом, даже линейные носители, подготовленные с помощью моноферментативного сдвига, не требуют конечной дефосфатизации. Ложно - положительные клоны (без вставок), возникающие после преобразования рекомбинантного продукта, образуются в результате преобразования полностью нелинейного кольцевого вектора ферментативной резьбы. Мы рекомендуем, чтобы рекуперация клея после ферментативного разреза снизила долю этого нелинейного носителя до низкого уровня zui.

(2) Обратный источник PCR: Рекомендуется использовать высокоточную ДНК - полимеразу для подготовки, если полоса амплификации одинакова, носитель может быть получен путем очистки продукта PCR (номер груза: DC012 - 50), в противном случае носитель может быть получен путем рекуперации клея (номер груза: DC011 - 50).

Примечание: Обратный PCR - протоплазмидный шаблон также является нелинейным носителем и может также привести к ложноположительному клонированию (без вставленных фрагментов), поэтому линейный носитель источника PCR (продукт PCR) перед очисткой переваривает протоплазмидный шаблон с помощью Dpn I - эндокринозы, которая может уменьшить фон и увеличить положительную скорость. Но, как правило, рекуперации клея достаточно, чтобы уменьшить долю этого нелинейного носителя до низкого уровня Zui, поэтому мы также рекомендуем рекуперацию клея для линейного носителя обратного источника PCR.

B: Подготовка вставленных фрагментов ДНК

(1) Общий принцип одноступенчатой бесшовной конструкции клонированных экстрактов заключается в том, что путем введения гомологичной последовательности на конце линейного клонированного носителя в конце цитирования 5 'конечный конец продукта расширения вставленного фрагмента 5' и 3 'содержит полностью идентичные последовательности wan (16 bp - 20 bp), соответствующие двум концам линейного клонированного носителя, соответственно.

(2) Конструкция вставленных фрагментов цитат: клонированные цитаты включают в себя вставленные фрагментарные специфичные последовательности цитат и перекрывающиеся последовательности.

Клонированная прямая кавычка (5 '- 3'): линейный носитель с прямой последовательностью перекрывающихся областей 16 - 25 nt (от 3 'конца) + вставка фрагмента с положительной специфичной последовательностью кавычек (18 - 25 nt)

Клонированные обратные кавычки (5 '- 3'): последовательность перекрывающихся областей с обратным 16 - 25 nt на линейном носителе (начиная с конца 3 ') + вставленные фрагменты с обратной специфичностью кавычек (18 - 25 nt)

Примечание: Базовое число щелочи в перекрывающейся области должно быть не менее 16 bp, а значение Тм между несколькими перекрывающимися областями должно быть согласовано и > 60 °C (AT pair = 2 ° C и GC pair = 4 ° C), в противном случае количество оснований может быть увеличено до тех пор, пока оно не будет соответствовать требованиям.

В соответствии со структурой конца линейного носителя (5 'Выделение, 3' Выделение, плоский конец), конструкция экстракта также разделена на три случая, что указывает на следующее:

Оба конца линейного носителя различаются линейными способами (например, моноферментная, биферментная, обратная PCR) и могут быть двумя или двумя произвольными комбинациями вышеуказанных трех конечных структур. Принципы специальной конструкции экстракта для вставки фрагментов соответствуют принципам общей конструкции экстракта.

При расчете температуры отжига амплифицированного экстракта необходимо только вычислить значение Тм специфической последовательности амплификации гена, а конечная гомологическая последовательность носителя не должна участвовать в вычислении.

(3) Выбор ферментов: Рекомендуется использование высокоточной ДНК - полимеразы или PCR Mix (товарные номера: P517 - 05 или P814 - 05).

(4) Условия реакции: как правило, в соответствии с инструкцией по использованию полимеразы.

(5) Очистить вставку

l Альтернативный вариант: Если фрагмент происходит от протоплазмидного шаблона, и эта плазмида имеет такую же устойчивость, как и рекомбинантный носитель, то перед очисткой протоплазмидный шаблон переваривается с помощью Dpn I - эндокринозы, что снижает фон и повышает положительную частоту.

l Если фрагмент единичный, рекомендуется очищать фрагмент с помощью упаковки реагента для очистки продуктов PCR (номер груза: DC012–100).

l В случае неспецифического усиления рекомендуется рекуперировать фрагменты в наборе для регенерации клея (номер груза: DC011 - 100).

l Используя этот метод клонирования, точки ферментативного сдвига, используемые для линейного носителя, будут отсутствовать при сращивании, и если есть строгие требования к точкам сдвига фермента, рекомендуется обратить внимание на выбор точек сдвига фермента, при необходимостиМежду перекрывающимися областями и специфическими генетическими последовательностямиДобавьте недостающие основания для восстановления изначальных точек ферментативного сдвига (см. примеры ниже).

l Если рекомбинантные плазмиды используются для экспрессии белка, обратите внимание на рамки чтения кода при проектировании экстракта, последовательности, необходимые для экспрессии и очистки белка (например, инициирующие частицы, последовательности RBS, инициирующие кодоны, заканчивающие криптоны, белковые метки и т. Д.), не будут повреждены.

Примеры положительной конструкции экстракта (EcoR I - ферментативное разрезание):

Как показано выше, носитель разрезается ферментом Ecor I, образуя 5 'выступающий конец:

В соответствии с вышеуказанными принципами проектирования, начиная с конца 3, обратный отсчет 16bp - 25bp (в этом примере используется та же последовательность, которая перекрывается концом 20 bp) может быть добавлен к предыдущему специфичному последовательности экстрактов целевого фрагмента. Удостоверьтесь, что значения Тм в перекрывающейся области совпадают и > 60°C (AT pair = 2°C и GC pair = 4°C).

Прямые экстракты: 5 'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGНННННННННННН 3'

Примечание: после того, как вышеупомянутая конструкция экстракта завершит клонирование соединения, точка сдвига EcoR I - фермента исчезнет (без сохранения точки сдвига фермента).

Если необходимо сохранить контакт EcoR I - фермента, необходимо заполнить недостающую последовательность EcoR I - идентификаторов aattc между перекрывающейся последовательностью 20 bp в конце носителя и специфичной последовательностью экстрактов целевого фрагмента, и после завершения клонирования контакт EcoR I - фермента все еще существует (сохраняет контакт фермента).

Конкретно: 5 'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Пример конструкции обратного экстракта (ферментативное разрезание Hind III):

Как показано выше, носитель разрезается ферментом Hind III, образуя 5 'выступающий конец:

В соответствии с вышеуказанными принципами проектирования, начиная с конца 3, обратный отсчет 16bp - 25bp (в этом примере используется та же последовательность, которая перекрывается концом 20 bp) может быть добавлен к предыдущему специфичному последовательности экстрактов целевого фрагмента. Удостоверьтесь, что значения Тм в перекрывающейся области совпадают и > 60°C (AT pair = 2°C и GC pair = 4°C).

Обратный экстракт: 5 'CTGCCATCGGATCGTTCGCAНННННННННННН 3'

Примечание: после того, как вышеупомянутая конструкция экстракта завершит клонирование соединения, точка сдвига Hind III исчезнет (без сохранения точки сдвига фермента).

Если необходимо сохранить точку сдвига фермента Hind III, необходимо заполнить недостающую последовательность идентификаторов Hind III agctt между перекрывающейся последовательностью 20 bp в конце носителя и специфической последовательностью экстрактов фрагмента назначения, и точка сдвига фермента Hind III все еще существует (точка сдвига фермента сохраняется).

Конкретно: 5 'CTGCCATCGGATCGTTCGCAagctt NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Операционные этапы бесшовной реакции клонирования:

Примечание: 2xOneStep Cloning Mix содержит усилитель соединения PEG очень вязкий, вытаскиваемый из холодильника при низкой температуре, может быть помещен в ручное замораживание в течение нескольких минут, чтобы повысить температуру, чтобы уменьшить вязкость (без ущерба для качества), легкая смесь, мгновенный центробежный сбор на дне трубки.

1. Построение реакционной системы в соответствии со следующей таблицей (может быть изготовлено при комнатной температуре с помощью трубки PCR)

* Носитель обычно используется 20 - 50 нг, вставленный фрагмент и Морби носителя оптимально между 2: 1 - 3: 1; Если вставленный фрагмент меньше 200bp, вставьте фрагмент с носителем Морби 5: 1.

2. Слегка смешать, в 50БРеакция C длится 15 минут (может быть выполнена на приборе PCR), после чего трубка PCR после установки на лед преобразуется или сохраняется непосредственно в - 20.БС. Более короткие сегменты, такие как 100bp - 1kb, получают достаточно преобразователей всего за 15 минут, а соединения более длинных сегментов могут продлить время реакции до 60 минут.

3. Возьмите 5 мкл реакционного продукта для преобразования в соответствии с инструкцией по сенсорным клеткам (если преобразователей меньше, все продукты могут быть преобразованы и все конверсионные жидкости покрыты пластинами).

Идентификация положительного клонирования:

В зависимости от конкретного случая, можно выбрать колонию для PCR - идентификации, экстракции плазмиды (товарный номер 31013 - 100) для ограничительной эндокринной идентификации или секвенирования.

Скачать One Step Seamless Cloning Kit