Скачать One Step Seamless Cloning Kit

НобледСкачать One Step Seamless Cloning Kit

Один шаг безшовный набор клонирования (Один фрагмент)

Номер каталога:42111

Упаковка:

Хранение продукции:-20БC Сохранить, чтобы избежать многократного замораживания

Параметры конкретного продукта зависят от параметров полученного описания продукта

Описание продукции:Одноступенчатый, бесшовный клонированный набор не зависит отТ4Ассоциированные ферменты, которые не ограничены точками сдвига ферментов носителя и сегмента цели, а непосредственно рекомбинантными методами перекрывающихся сегментов, с помощью специальной комбинации ферментов могут линейно использовать любой метод после носителя и его обоих концов16-25bpперекрывающийсяПЦРФрагмент направленного рекомбинантного соединения, можно30Достижение в течение минутыAКонец или плоский конецПЦРФрагменты продукта эффективно направлены и бесшовно клонируются в любую точку носителя.

Характеристики продукта:

1. 30Одна минута может быть50bp-15kb ПЦРРасширенный сегмент (плоский)/ АКонец) клонирование вставляется в произвольное положение любого носителя.

2.Доступность свободных от носителя и вставленных фрагментарных ферментовМирный конец/粘性末端的限Изготовление, может быть клонировано в любой точке.

3. Бесшовное клонирование, точка вставки не вводит ненужные последовательности оснований.

4. Не полагаясь на соединительные ферменты и фосфатазы, эффективный, точный, клонированный положительный до95%Выше.

Схема принципа одноступенчатого бесшовного клонирования наборов реагентов:

Линейный носитель и вставкаДНКПодготовка фрагментов:

A: Подготовка линейных носителей

(1).Источники ферментации:Линейный носитель, полученный в результате ферментативного сдвига, плоский конец или липкий конец, моноферментный сдвиг или биферментный сдвиг могут быть восстановлены после ферментативного сдвига клея.

Примечание: Одноступенчатый метод без двойной цепи в системе реакции клонированияДНКАссоциированные ферменты, которые не реагируют на самоподключение носителя. Таким образом, даже линейные носители, подготовленные с помощью моноферментативного сдвига, не требуют конечной дефосфатизации. Ложно - положительные клоны после преобразования рекомбинантных продуктов(Нет вставленных фрагментов)Он образуется в результате преобразования нелинейного кольцевого вектора с ферментным резанием Quan. Мы рекомендуем рекуперацию клея после ферментативного разреза, чтобы уменьшить эту нелинейную долю носителя до максимального уровня di.

(2).обратныйПЦРИсточник:Рекомендуется использовать высокий уровеньДНКПолимераза (номер груза:P517-05илиP812-05Приготовление, если полоса усиления одна может пройтиПЦРОчищение продуктов (номер груза:DC012-50(Получение носителя, в противном случае путем рекуперации клеем (номер груза:DC011-50)Приобретение носителя.

Примечание: ОбратныйПЦРШаблоны плазмиды также являются нелинейными носителями, которые также могут привести к ложноположительному клонированию (без вставленных фрагментов), поэтомуПЦРИсточник (ПЦРПродукт) Предочистительное использованиеДПН IШаблоны пищеварительной плазмиды эндокринозы могут уменьшить фон и повысить положительную частоту. Но, как правило, рекуперации клея достаточно, чтобы уменьшить долю этого нелинейного носителя до максимума di и, следовательно, обратноПЦРЛинейный носитель источника Мы также рекомендуем рекуперацию клея.

B: ВставитьДНКПодготовка фрагментов

(1).Общий принцип одноступенчатого бесшовного клонирования экстракта заключается в следующем:5 'Конец вводит концевую гомологичную последовательность линейного клонированного носителя, что позволяет вставлять продукты расширения фрагментов5 'и3 'Конец содержит последовательности, соответствующие двум концам линейного клонированного носителя.(16 bp)...20 bp)А.

(2).Конструкция вставленных фрагментов цитат: клонированные цитаты включают в себя вставленные фрагментарные специфичные последовательности цитат и перекрывающиеся последовательности.

Клонирование прямых экстрактов(5’-3’): Линейный носитель прямо16-25 ntПоследовательность перекрывающихся зон(3« Конец отсчитывается.) +Вставить прямую специфичную последовательность экстрактов фрагмента (18-25 nt)

Обратный клон(5’-3’): Линейная обратная сторона носителя16-25 ntПоследовательность перекрывающихся зон(3« Конец отсчитывается.) +Вставить фрагмент с обратной специфичной последовательностью экстрактов (18-25 nt)

Примечание: Базовое количество щелочей в перекрывающихся зонах по крайней мере16 bpИ между несколькими перекрывающимися зонамиТМЗначение должно быть последовательным и >60°C (пара AT = 2°C и пара GC = 4°C)В противном случае количество оснований может быть увеличено до соответствия требованиям.

В соответствии со структурой конца линейного носителя (5« Выдающийся,3« Выделение, плоский конец), дизайн экстракта также делится3Виды ситуаций, обозначенные следующим образом:

Оба конца линейного носителя линейны линейными способами (например, моноферментная, биферментная, обратная)ПЦРВ отличие от этого, это может быть две или две произвольные комбинации из трех вышеуказанных конечных структур, и принцип вставки фрагментарной специфичной конструкции экстракта должен соответствовать принципам общей конструкции экстракта.

При расчете температуры отжига расширенного экстракта необходимо вычислить только специфическую последовательность усиления гена.ТМЗначения, концевые гомологичные последовательности носителя не должны участвовать в вычислениях.

(3).Выбор фермента: рекомендуется использовать высокий уровень достоверностиДНКПолимеразы илиПЦР смесь(Номер груза:P517-05илиP814-05В)).

(4).Условия реакции: как правило, в соответствии с инструкцией по использованию полимеразы.

(5).Очистить вставку

l Альтернативный вариант: если фрагмент происходит от протоплазмидного шаблона, и плазмида имеет такую же устойчивость, как и рекомбинантный носитель, перед очисткойДПН IШаблон пищеварительной плазмиды эндокринозы, который уменьшает фон и повышает положительную частоту.

l Если фрагмент один, рекомендуется использоватьПЦРНабор для очистки продуктов (номер груза:DC012-100) Очищенный фрагмент.

l В случае неспецифического усиления рекомендуется рекуперировать комплект реагента клеем (номер груза:DC011-100)Рекуперация фрагментов.

l Используя этот метод клонирования, точки ферментативного сдвига, используемые для линейного носителя, будут отсутствовать при сращивании, и если есть строгие требования к точкам сдвига фермента, рекомендуется обратить внимание на выбор точек сдвига фермента, при необходимостиМежду перекрывающимися областями и специфическими генетическими последовательностямиДобавьте недостающие основания для восстановления изначальных точек ферментативного сдвига (см. примеры ниже).

l Если рекомбинантные плазмиды используются для экспрессии белка, обратите внимание на последовательность, необходимую для чтения кодовых рамок, экспрессии белка и очистки при проектировании экстракта (например, инициатор,РБСПоследовательность, начальный кодон, конец кодон, белковые метки и т.д.) не разрушается.

Примеры положительной конструкции (ЭкоР IФерментная резка):

Как показано выше, носитель состоит изЭкор IФерментное разрезание, образование5« Выдающийся конец:

В соответствии с вышеуказанными принципами проектирования,3"Конец начинает вычислять, обратный отсчет16bp-25bp(В данном примере используется20 bpКонец перекрывает одну и ту же последовательность), добавляя перед специальной последовательностью экстрактов целевого фрагмента. Обеспечение перекрывающихся зонТМЗначения совпадают и >60°C (пара AT = 2°C и пара GC = 4°C)А.

Прямые ссылки:5 'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNN3 '

Примечание: после того, как вышеупомянутая конструкция экстракта завершит клонирование соединения,ЭкоР IТочки сдвига фермента исчезнут (без сохранения точек сдвига фермента).

Если необходимо сохранитьЭкоР IПозиции фермента должны быть в конце носителя.20 bpНедостающая последовательность между перекрывающимися и целевыми фрагментамиЭкоР IПоследовательность точек идентификацииААТЦПосле завершения клонирования соединения,ЭкоР IПозиции ферментативного среза все еще существуют (удерживающие точки ферментативного среза).

В частности:5 ' GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3 '

Примеры конструкции обратного экстракта (Хинд IIIФерментная резка):

Как показано выше, носитель состоит изХинд IIIФерментное разрезание, образование5« Выдающийся конец:

В соответствии с вышеуказанными принципами проектирования,3"Конец начинает вычислять, обратный отсчет16bp-25bp(В данном примере используется20 bpКонец перекрывает одну и ту же последовательность), добавляя перед специальной последовательностью экстрактов целевого фрагмента. Обеспечение перекрывающихся зонТМЗначения совпадают и >60°C (пара AT = 2°C и пара GC = 4°C)А.

Обратная ссылка:5 'CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Примечание: после того, как вышеупомянутая конструкция экстракта завершит клонирование соединения,Хинд IIIТочки сдвига исчезнут (без сохранения точек сдвига фермента).

Если необходимо сохранитьХинд IIIПозиции фермента должны быть в конце носителя.20 bpНедостающая последовательность между перекрывающимися и целевыми фрагментамиХинд IIIПоследовательность точек идентификацииагкттА,Хинд IIIПозиции ферментативного среза все еще существуют (удерживающие точки ферментативного среза).

В частности:5 ' CTGCCATCGGATCGTTCGCA агctt NNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Операционные этапы бесшовной реакции клонирования:

Внимание:2 × OneStep Клонирование смесиСодержит усилители соединений.ПЭГОчень вязкий, вынимает из холодильника низкую температуру, когда более вязкий, может быть помещен в ладонь замораживания в течение нескольких минут, чтобы повысить температуру может снизить вязкость (не влияет на качество), легкая бомба смешивается, мгновенно центробежная сборка на дне трубки.

1. Создать систему реакции в соответствии со следующей таблицей (можно использоватьПЦРТрубка при комнатной температуре)

* Перевозчик обычно20-50 ngВставить фрагмент с носителем Морби в2: 1–3: 1Между лучшими; Если вставка меньше200bpВставить фрагмент с носителем для Морби5: 1А.

2. Слегка смешать, в50БCРеакция15Минуты (можноПЦРПроводится на приборе), после окончания реакции будетПЦРПосле того, как труба была помещена на лед, она была преобразована или сохранена.-20БC. Более короткие фрагменты, например100bp-1kbпросто нужно15За минуту достаточно преобразователей, более длинных фрагментов соединения, чтобы продлить время реакции до60Минут.

3. 取5 мклРеакционные продукты преобразуются в соответствии с инструкциями по сенсорным клеткам (если преобразователей меньше, все продукты могут быть преобразованы и все конверсионные жидкости покрыты пластинами).

Идентификация положительного клонирования:

В зависимости от конкретного случая можно выбрать колонию.ПЦРИдентификация, извлечение плазмиды (номер груза)31013 - 100Проведение ограничительной эндокринной идентификации или секвенирования.

Скачать One Step Seamless Cloning Kit