PBLUE - T - вектор Клонированный реактив T4 Принципиальный носитель и другие

НобледPBLUE - T - вектор Клонированный реактив T4 Принципиальный носитель и другие

PBLUE - T - клонированный набор

Номер каталога: 42014

Состав комплекта, хранение, стабильность:

- Хранение при температуре 20°С без ущерба для эффективности использования в течение 6 месяцев.

Параметры конкретного продукта зависят от параметров полученного описания продукта

Презентация продукции:

Многие высокотемпературные ДНК - полимеразы, такие как Taq DNA полимераза, Tth DNA полимераза и другие расширенные продукты PCR в 3 '-В конце есть выдающееся основание А, и такой продукт PCR может быть использован 3 '.-В конце носителя с выделенным основанием Т легко клонировать. Перевозчик pBLUE - T происходит из плазмиды pBlueScript II SK (+), добавляя соответствующие последовательности к месту сдвига фермента EcoRI, который после разреза фермента XCM I непосредственно генерирует несовместимые Т - основания и, следовательно, имеет более высокую эффективность рекомбинации. носитель pBLUE - T вставляет два отдельных ECOR I - участка на обоих концах, так что вставленный фрагмент может быть обнаружен с помощью недорогого и эффективного ECOR I - монофермента; В то же время носитель pBLUE - T не содержит NdeI или NcoI - ограниченных эндокринных участков и может быть легко использован для клонирования генов, содержащих вышеупомянутые участки фермента. Кроме того, наша система соединения носителей также имеет характеристики низкого фона (синее пятно менее 10%), высокой скорости рекомбинации (более 90% вставленных фрагментов в белом пятне), быстрого соединения и так далее. В конце этой инструкции перечислены технические данные, относящиеся к носителям pBLUE - T, полная последовательность которых может быть отсылкой к последовательности pBlueScript II SK (+), за исключением того, что последовательность точек касательства поликлональных ферментов несколько отличается.

Секвенирование может осуществляться с использованием T3, T7 - инициирующих и M13 - универсальных секвенирующих экстрактов (см. диаграмму ниже).

Шаги действия:

1. Подготовка реакции соединения:

Очищение продуктов PCR зависит от качества продуктов амплификации. Если продукт PCR очень чистый, реакция соединения может быть проведена непосредственно без очистки. Однако, если продукт PCR изготовлен по образцу плазмиды, он должен быть очищен, и плазмиды шаблона могут также образовывать белые пятна. PCRПродукты могут быть отделены электрофорезом агариновым гелем. Наша компания производит быстрое очищение продуктов ДНК в наборах для восстановления 7Фрагменты ДНК размером более 0bp могут быть хорошо переработаны.

Taq, Tth, AmpliTaq, Klentaq DNA полимеразы амплифицированные продукты PCR, все с выдающейся 3 '-AА. Иметь3 '-Продукт PCR в конце А может быть клонирован непосредственно с помощью носителя pBLUE - T. Имеет 3 '®5 « Продукт PCR, усиленный экстенсивной активностью ДНК - полимеразы (высокофакторных ферментов), является плоским концом, и для клонирования этого продукта PCR с плоским концом он должен быть хорошо выполнен 3».-Дуань Плюс А работает.

2. Обычная реакция соединения:

1) В стандартной 10ml Соединить реакционную систему, добавить 1mл30% от Pblue - TПеревозчик, Xml ПЦРПродукт (в обычных условиях нет необходимостиПЦРПродукт для точной количественной оценки, общий продукт PCR и носитель Морби оптимизации до 2: 1 ~ 10: 1 может получить хорошие результаты, рекомендуется 3: 1),1ml 10Абуфер связыванияи 0.5 - 1mл(2.5 - 5 ДНК T4 Weiss Units)Ligase， Остальное восполняется водой. Реакция осуществляется по следующей системе:

В конце обычно добавляют T4 DNA Ligase.

2) Соединение с температурой 16°C на ночь (обычно может быть сделано с помощью прибора PCR).

Как правило, рекомендуется 16 ° C соединение на ночь (10)mlСтандартное количество соединительных ферментов составляет 2,5.единицы WeissДостаточно) можно получить наибольшее количество преобразователей. Тем не менее, PEG Enhancer повышает эффективность соединения в несколько раз.，При высоких количествах соединительных ферментов (10)mlРекомендуемое количество соединений 5.единицы WeissПодключение 16°C в течение 30 минут соответствует требованиям общего исследования.

3)Лед охлаждается, затем преобразуется или хранится при 20°C.

3. Быстрая реакция соединения:

1) Реакция осуществляется по следующей системе:

В конце обычно добавляют T4 DNA Ligase.

2) Подключение при температуре 22°С в течение 5 - 10 минут (обычно может быть выполнено при помощи прибора PCR).

2 АQuick Ligation Buffer уже содержит все оптимизированные компоненты быстрого соединения и обычно рекомендуется подключение при температуре 22°C в течение 10 минут.(10)mlКоличество соединений 5.единицы WeissДлинные фрагментарные соединения могут быть продлены до 30 минут) В целом можно получить удовлетворительный результат. Кроме того, система может быть подключена при температуре 16°C в течение 30 минут (10)mlКоличество соединений 5.Weiss Units) отвечает требованиям общего исследования.

3)Лед охлаждается, затем преобразуется или хранится при 20°C.

4. Преобразование:

Б50 - 100ml Чувствительные клетки, помещаемые на лед, после размораживания Quan несколько раз слегка вытирают, чтобы равномерно взвесить клетки.

БПрисоединение 4 - 5mlСоединительная жидкость (до полного добавления, при условии, что объем не превышает 1 / 10 объема клетки в чувственном состоянии), мягко перемешивается. На льду.Тридцать минут. 42°C Тепловая ванна 90Секунда. На льду 2.~ 3 минуты.

БПлюс 500mL LB или SOC питательная среда (без антибиотиков), 37° 150 rpmВибрация культивируется в течение 60 минут.

ББудет 200mlБактерии наносятся заранее 16.mл 50мг/мл IPTGи 40ml 20 мг / мл X - gal покрыт аминобензилом qing на планшете.

Использование покрытых бактерий корректируется в зависимости от эффективности соединения и восприимчивости клеток, если ожидается меньшее количество клонирования, часть питательной жидкости может быть высосана центрифугой (4000 rpm, 2 минуты), после чего соответствующее количество суспензии питательной среды может быть полностью или в умеренном количестве покрыто пластиной (оставшаяся бактериальная жидкость, покрытая покрытием, может быть сохранена на 4 градуса, на второй день, если количество преобразованных колоний невелико, остаточная бактериальная жидкость может быть покрыта новой питательной пластиной).

БПластина помещается в сторону при 37°C в течение часа, чтобы поглотить слишком много жидкости, а затем перевернуть культуру на ночь.
5 Скрининг:

1). Сине - белый фильтр преобразователя:

Когда экзогенные фрагменты ДНК вставляются в pBLUE - TПозже, благодаря внешним источникамНаличие нуклеиновых последовательностей ДНК изменяет кодирование гена LacZ, что влияет на его продуктыb-Гексагликозазаа-Фрагмент активирован, поэтому рекомбинантный клон представлен белым на пластине X - gal / IPTG, а не рекомбинантный клон - синим. Иногда.Вставка не влияетРамка считывания гена lacZ или вставка фрагмента слишком мала, в этом случае колония (рекомбинантный клон) имеет бледно - синий цвет или бледно - синие пятна в центре колонии, а внешний круг белый (рыбий глаз голубое пятно fish eye). Выберите белую или светло - голубую колонию, выращенную на планшете IPTG / X - gal, выберите жидкую среду, содержащую бензилцин, с помощью зубочистки и культивируйте при 37°C на ночь.
2) Идентификация трансформаторов:

а.Экстракция плазмиды с помощью бактериальной жидкости, выращенной в белых колониях, описанных выше, с помощью монофермента ECOR I или другого подходящего фермента, электрофорез агаринового геля проверяет размер фрагмента, чтобы определить, содержит ли он целевой фрагмент.

b.Выделение белых колоний для прямого тестирования методом PCR (см. 3 - ю версию молекулярного клонирования или проконсультируйтесь с нами)

c) использование инициирующих экстрактов T3 и T7 или других подходящих последовательностей экстрактов для определения наличия клонирования в целях.

Как рассчитать количество продуктов PCR, необходимых для реакции соединения?

Общие продукты PCR и носители оптимизированы по морби до 2: 1 ~ 10: 1 (рекомендуется 3: 1), чтобы получить хороший результат, можно использовать следующую формулу:

[Количество добавленного носителя (g) x Размер вставленного фрагмента (kb) x Размер вставленного фрагмента (kb) x Размер вставленного фрагмента (kb) x Молби вставленного фрагмента и количество вставленного фрагмента носителя = количество вставленного фрагмента (g), например: соотношение моля между вставленным фрагментом и соединением носителя составляет 3: 1, если в реакцию соединения добавляется носитель 40 нг, размер вставленного фрагмента составляет 1000 bp, тогда количество вставленного фрагмента должно быть добавлено в [40ng носитель × 1kb Вставить фрагмент носитель 2.984kb носитель] ×

PBLUE - T - вектор Клонированный реактив T4 Принципиальный носитель и другие