Принцип быстрого клонирования T4

НУЛЬ-ГлупыйНабор для быстрого клонирования с плоским концом с нулевым фоном

Принцип быстрого клонирования T4

Номер каталога:42018

Состав комплекта, хранение, стабильность:

- Хранение при температуре 20°С без ущерба для эффективности использования в течение 6 месяцев.

v Презентация продукции:

Аптечка быстрого соединения с нулевым фоном с плоским концом представляет собой превосходную систему клонирования с Zi - фунгицидным выбором, которая может эффективно клонировать продукт PCR с плоским концом и любой фрагмент ДНК с плоским концом. Набор эффективен как для фосфатированных, так и для нефосфатированных фрагментов ДНК. Для получения более 95% положительных рекомбинантных клонов требуется всего 5 минут для позитивного выбора носителя и вставки фрагмента соединения. Плоскоконечный продукт PCR, усиленный полимеразой с корректирующей активностью (например, Pfu polymerase), может быть напрямую связан с клонированным носителем. Соединительные продукты могут непосредственно преобразовывать распространенные штаммы кишечной палочки.

Набор реактивов предлагает новый Zi - фунгицидный генетически позитивный выбор для клонирования носителя pZERO - Blunt. Этот носитель содержит смертельный Zi - фунгицид (с множественными клонированными участками), и когда носитель успешно соединяется с фрагментом, Zi - фунгицид не может быть правильно выражен, и клетки, содержащие рекомбинанты, могут нормально расти; Когда носитель не удается подключиться к фрагменту, носитель самосвязывается после того, как гены zi - фунгицида правильно выражены, клетки, содержащие автономный пустой носитель, не могут выжить, то есть фон « нулевого ZERO». Эта позитивная стратегия скрининга не требует сине - белого скрининга, что значительно ускоряет процесс скрининга клонов.

Для облегчения работы с ферментативным срезом и вставкой фрагментарных генов клонированный носитель pZERO - Blunt содержит по одной последовательности распознавания BglII с каждой стороны. Кроме того, носитель содержит инициатор T7, который может использоваться для внутренней или внешней транскрипции, секвенирования вставленных фрагментов и других исследований.

Шаги действия:

1. Подготовка реакции соединения:

Плоскоконечный продукт PCR или плоский концевой фрагмент фермента может быть восстановлен путем электрофоретического разделения агаринового геля (с помощью длинноволнового ультрафиолетового или видимого пропускающего клея, чтобы избежать повреждения ДНК, вызванного сбоем соединения). Морби с носителем 3: 1. Наборы для быстрой очистки продуктов ДНК, производимые нашей компанией, хорошо перерабатывают более 70 bp фрагментов ДНК.

2. Быстрая реакция соединения:

1) В стандартном 10ml Соединить реакционную систему, добавить 1mL 40, < NUM > pzero тупой Ch # 1ml Продукты PCR (в обычных условиях нет необходимости в точной количественной оценке продуктов PCR, общий продукт PCR и носитель Морби оптимизированы до 1: 1 ~ 10: 1 для получения хороших результатов, рекомендуется 3: 1, см. добавление), 5ml 2А& quot; Quick Light Buffer & quot; и 0,9mL T4 ДНК Ligase, остальные восполняются стерилизованной водой.

Реакция осуществляется по следующей системе:

В конце обычно добавляют T4 DNA Ligase.

2) Подключение при температуре 22°C в течение 5 - 10 минут (обычно может быть выполнено с помощью прибора PCR).

Как правило, рекомендуется подключение при температуре 22°C в течение 5 - 10 минут, > 3kb длинное соединение может быть продлено до 30 минут. Не рекомендуется более 30 минут, сверх того, что может снизить количество трансформирующих подпространств.

3) Лед охлаждается, затем преобразуется или хранится при 20°C.

3. Преобразование:

1) 100mL чувственные клетки, помещенные на лед, wan после полного оттаивания несколько раз легкий шан, чтобы равномерно взвесить клетки.

2) Присоединение 4 - 5ml Соединительная жидкость (до полного добавления, при условии, что объем соединительной жидкости не превышает 1 / 10 объема клетки в чувственном состоянии), мягко перемешивается. Оставить лед на 30 минут.

3) Температура водяной ванны 42°C составляет 90 секунд. Лед помещается на 2 - 3 минуты.

4) Плюс 500.mL LB или SOC питательная среда (без антибиотиков), с вибрационной культурой 37° 150 rpm в течение 60 минут.

5) Будет 200mБактерии, покрытые бензилом пенициллина (100)mg / ml) На планшете.

Использование покрытых бактерий корректируется в зависимости от эффективности соединения и восприимчивости клеток, если ожидается меньшее количество клонирования, часть питательной жидкости может быть высосана центрифугой (4000 rpm, 2 минуты), после чего соответствующее количество суспензии питательной среды может быть полностью или в умеренном количестве покрыто пластиной (оставшаяся бактериальная жидкость, покрытая покрытием, может быть сохранена на 4 градуса, на второй день, если количество преобразованных колоний невелико, остаточная бактериальная жидкость может быть покрыта новой питательной пластиной).

6) Пластина помещается в сторону при 37°C в течение часа, чтобы поглотить слишком много жидкости, а затем перевернуть культуру на ночь.

5 Скрининг:

1). Регулярное тестирование: прививка полученных колоний 1 - 5 мл ЛБ (с конечной концентрацией 100)mg / мл ампициллиновой плесени) питательная среда, вибрационная культура в качающемся слое 37°C на ночь, извлечение плазмиды после сохранения вида, применение метода PCR или ферментативного резания для определения правильности вставленного фрагмента.

2) Экспресс - тестирование: отбор колоний для непосредственного тестирования методом PCR (см. версию 3 молекулярного клонирования или описание комплекта реагентов PCR для идентификации колоний CV05 - General T - носителей компании).
3). Секвенирование идентификация: секвенирование инициируемых экстрактов с использованием наборов реагентов или инициирующих экстрактов T7 для определения того, содержит ли он клонирование для целей.

Этот комплект содержит свои собственные секвенированные экстракты (также используемые для идентификации колоний методом PCR):

v Добавление:

в Как рассчитать количество продуктов PCR, необходимых для реакции соединения?

Общие продукты PCR и носители оптимизации Морби до 1: 1 ~ 10: 1 (рекомендуется 3: 1) могут получить хороший результат, можно использовать следующую формулу:

[Количество добавленного носителя (g) × Размер вставленного фрагмента (kb) × Размер вставленного фрагмента (kb) × Размер вставленного фрагмента (kb) × Морби вставленного фрагмента и количество вставленного фрагмента (g) носителя = количество вставленного фрагмента (g), например: соотношение моля между вставленным фрагментом и соединением носителя составляет 3: 1, если в реакцию соединения добавлен носитель 40 нг, размер вставленного фрагмента составляет 500 bp, тогда количество вставленного фрагмента должно быть добавлено в [40ng носитель × 0,5 kb вставленный фрагмент носитель 2.97

Принцип быстрого клонирования T4