PBLUE - T Simple Быстрый клонированный набор T4

pBLUE-T ПростойКомплект для быстрого клонирования носителей

PBLUE - T Simple Быстрый клонированный набор T4

Номер каталога:42119

Состав комплекта, хранение, стабильность:

- Хранение при температуре 20°С без ущерба для эффективности использования в течение 6 месяцев.

Презентация продукции:

PBLUE - T Simple Vector является специализированным носителем высокоэффективного клонирования продукта PCR (TA Cloning). Этот носитель был преобразован из плазмиды pBlueScript II SK (+), в отличие от традиционного метода T - носителя ECOR V после разреза и добавления T, pSURE - T Simple, путем преобразования pBlueScript II SK (+), путем введения фермента Xcm I в исходном поликлонированном участке pBlueScript II SK (+) непосредственно генерирует несовместимые Т - основания на 3 'концах с обеих сторон исходного поликлонированного участка, что делает его более эффективной реорганизацией. В то же время он устраняет точки сдвига поликлоназы на носителях pBlueScript II SK (+), которые требуют введения подходящих точек сдвига фермента на экстракте PCR - ампликатора. На этом этапе, если резка ДНК - фермента производится с использованием точки ферментативного сдвига, импортированной экстрактом с амплификацией PCR, реакция ферментативного сдвига не будет зависеть от ограничивающих ферментов на других точках сдвига поликлональных ферментов на Т - носителе, что может значительно повысить эффективность ферментативного сдвига и увеличить успех субклонирования. Кроме того, наша система соединения носителей также имеет характеристики низкого фона (синее пятно менее 10%), высокой скорости рекомбинации (более 90% вставленных фрагментов в белом пятне), быстрого соединения и так далее. В конце этой инструкции перечислены технические данные, относящиеся к носителям pBLUE - T Simple, вся последовательность которых может быть отсылкой к последовательности pBlueScript II SK (+), за исключением нескольких различий в последовательности касательных точек поликлональных ферментов.

Для секвенирования рекомендуется использовать универсальную секвенированную цитату M13 и инициирующую цитату T3 (см. диаграмму ниже).
Шаги действия:
1. Подготовка к реакции соединения

Очищение продуктов PCR зависит от качества продуктов амплификации. Если продукт PCR очень чистый, реакция соединения может быть проведена непосредственно без очистки. Однако, если продукт PCR изготовлен по образцу плазмиды, он должен быть очищен, и плазмиды шаблона могут также образовывать белые пятна. Продукты PCR могут быть отделены электрофорезом агариновым гелем. Наборы для быстрой очистки продуктов ДНК, производимые нашей компанией, хорошо перерабатывают более 70 bp фрагментов ДНК.

Taq, Tth, AmpliTaq, Klentaq DNA полимеразы амплифицированные продукты PCR, все с выдающейся 3 '-А. Есть 3 '-Продукт PCR в конце А может быть клонирован непосредственно с помощью носителя pBLUE - T Simple. Имеет 3 '®5 « Продукт PCR с расширенной ДНК - полимеразой (высокофакторным ферментом), активированным экстензом, является плоским концом, и для клонирования этого продукта PCR с плоским концом необходимо сначала выполнить 3 '­-Дуань Плюс А работает.

2. Обычная реакция соединения:

1) В стандартном 10ml Соединить реакционную систему, добавить 1mL 30% pblue - t Простойml Продукты PCR (в обычных условиях нет необходимости в точной количественной оценке продуктов PCR, общий продукт PCR и носитель Морби оптимизированы до 2: 1 ~ 10: 1 для получения хороших результатов, рекомендуется 3: 1), 1ml 10АСветильный буфер и 0,5 - 1ml (2.5 - 5 Weiss Units) T4 ДНК Ligase, остальная часть восполняется водой. Реакция осуществляется по следующей системе:

В конце обычно добавляют T4 DNA Ligase.

2) Подключение при 16°C на ночь (обычно может быть сделано с помощью прибора PCR).

Как правило, рекомендуется 16 ° C соединение на ночь (10)ml Стандартное количество соединительных ферментов в системе составляет 2,5 Weiss Units), что позволяет получить наибольшее количество преобразователей. Но система, содержащая PEG Enhancer, может в несколько раз повысить эффективность соединения при большом количестве соединительных ферментов (10).ml Рекомендуемое количество связывающих ферментов 5 Weiss Units) Подключение при температуре 16°C в течение 30 минут соответствует требованиям общего исследования.

3) Лед охлаждается, затем преобразуется или хранится при 20°C.

3. Быстрая реакция соединения:

1) Реакция осуществляется по следующей системе:

В конце обычно добавляют T4 DNA Ligase.

2) Подключение при температуре 22°C в течение 5 - 10 минут (обычно может быть выполнено с помощью прибора PCR).

2 АQuick Ligation Buffer уже содержит все оптимизированные компоненты быстрого соединения и обычно рекомендуется подключение при температуре 22°C в течение 10 минут (10).mКоличество соединительных ферментов системы составляет 5 Weiss Units, а длинные сегментные соединения могут быть продлены до 30 минут). Кроме того, система может быть подключена при температуре 16°C в течение 30 минут (10)mКоличество связывающих ферментов в системе 5 Weiss Units соответствует требованиям общего исследования.

3) Лед охлаждается, затем преобразуется или хранится при 20°C.

4. Преобразование:

в 50 - 100mL чувственные клетки, помещенные на лед, wan после полного оттаивания несколько раз легкий шан, чтобы равномерно взвесить клетки.

в Присоединение 4 - 5ml Соединительная жидкость (может быть добавлена полностью до тех пор, пока объем не превышает 1 / 10 объема клетки в чувственном состоянии), мягко перемешивается. Оставить лед на 30 минут. Температура водяной ванны 42°C составляет 90 секунд. Лед помещается на 2 - 3 минуты.

в Плюс 500.mL LB или SOC питательная среда (без антибиотиков), с вибрационной культурой 37° 150 rpm в течение 60 минут.

в Будет 200mБактерии наносятся заранее 16.m50 мг / мл IPTG и 40 мгml 20 мг / мл X - gal покрыт бензилом на планшете пенициллина.

Использование покрытых бактерий корректируется в зависимости от эффективности соединения и восприимчивости клеток, если ожидается меньшее количество клонирования, часть питательной жидкости может быть высосана центрифугой (4000 rpm, 2 минуты), после чего соответствующее количество суспензии питательной среды может быть извлечено полностью или в умеренном количестве покрыто пластиной (оставшаяся бактериальная жидкость может быть сохранена при 4 градусах, а на второй день, если количество преобразованных колоний невелико, остаточная бактериальная жидкость может быть покрыта новой питательной пластиной).

в Пластина помещается в сторону при 37°C в течение часа, чтобы поглотить слишком много жидкости, а затем перевернуть культуру на ночь.

5 Скрининг:

1). Сине - белый фильтр преобразователя:

Когда фрагменты экзогенной ДНК вставляются в pBLUE - T Simple, наличие нуклеиновой кислоты в экзогенной ДНК изменяет кодирование гена LacZ, что влияет на его продуктыb-Гексагликозазаа-Фрагмент активирован, поэтому рекомбинантный клон представлен белым на пластине X - gal / IPTG, а не рекомбинантный клон - синим. Иногда вставка фрагмента не влияет на рамку считывания гена lacZ или вставка фрагмента слишком мала, в этом случае колония (рекомбинантный клон) имеет бледно - синий цвет или бледно - голубое пятно в центре колонии с белым внешним кольцом (рыбий глаз голубое пятно fish eye). Выберите белую или светло - голубую колонию, выращенную на планшете IPTG / X - gal, выберите жидкую среду, содержащую бензил - пенициллин, с помощью зубочистки и культивируйте ее при температуре 37°C на ночь.

2) Идентификация трансформаторов:

а. Экстракция плазмиды с помощью бактериальной жидкости, выращенной в белых колониях, описанных выше, с помощью ферментативной резьбы, содержащейся в вставленном фрагменте, и электрофорез агаринового геля проверяют размер фрагмента, чтобы определить, содержит ли он целевой фрагмент.

b. Выберите белую колонию для прямого теста PCR

с. Для определения того, содержит ли клон цель, используются инициирующие цитаты T3 или секвенирующие экстракты общего секвенирования M13.

в Как рассчитать количество продуктов PCR, необходимых для реакции соединения?

Общие продукты PCR и носители оптимизированы по морби до 2: 1 ~ 10: 1 (рекомендуется 3: 1), чтобы получить хороший результат, можно использовать следующую формулу:

[Количество добавленного носителя (g) x Размер вставленного фрагмента (kb) x Размер вставленного фрагмента (kb) x Размер вставленного фрагмента (kb) x Молби вставленного фрагмента и количество вставленного фрагмента носителя = количество вставленного фрагмента (g), например: соотношение моля между вставленным фрагментом и соединением носителя составляет 3: 1, если в реакцию соединения добавляется носитель 40 нг, размер вставленного фрагмента составляет 1000 bp, тогда количество вставленного фрагмента должно быть добавлено в [40ng носитель × 1kb Вставить фрагмент носитель 2.928 kb] x 3 /

PBLUE - T Simple Быстрый клонированный набор T4