артикул：B1013/4/5/6

Условия хранения:: Хранение - 20°C, компонент А должен избегать света, чтобы избежать повторного замораживания и таяния.

Компоненты продукцииА.

Описание продукта

Отличительной особенностью цитопатии является разложение клеточной хромосомной ДНК, которое является очень специфическим и регулярным, в результате чего фрагменты ДНК различной длины в несколько раз больше, чем 180 bp - 200 bp, что проявляется в специфической трапезной диаграмме Ладдера в электрофорезе агаринового геля. В этом наборе используется метод TUNEL для каталитического включения YF в конце 3 - OH сломанной ДНК в апоптотических клетках с использованием концевого метафермента дезоксирибонуклеотида (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT). ®/ Cy-dUTP，YF ®/ ДНК, отмеченная Cy - dUTP, может быть замечена непосредственно с помощью флуоресцентного микроскопа или количественно измерена с помощью проточного цитометра. Метод TUNEL может избирательно обнаруживать опавшие клетки, а не некротические клетки или клетки с разрывом цепи ДНК, вызванным облучением и медикаментозной терапией. Маркированный dUTP (например, геосин - dUTP, биовуцин - dUTP), который может быть непосредственно обнаружен на месте, является более быстрым и прямым средством обнаружения.

Этот набор широко используется для обнаружения клеточного апоптоза в замороженных или парафиновых срезах, а также для обнаружения апоптоза культивируемых клеток стенки или суспензии. Избирательно обнаруживаются мертвые клетки, а не некротические клетки или клетки с разрывом цепи ДНК в результате облучения и медикаментозной терапии. Этот набор реагентов обнаруживает отмирание клеток, занимает короткое время, просто шаг реакции окрашивания, после стирки можно обнаружить.

способ применения

Экспериментальные материалы (собственные)

Буфер PBS (pH ~ 7.4)

0.4% Triton X - 100 (PBS - сборка)

0.1% Triton X - 100 (PBS, включая 5 мг / мLBSA)

4% полиформальдегид (PBS)

Иммуногенетическая ручка

Растворитель для депарафинирования (образец парафинового среза)

Реактор для обработки парафиновых срезов

антифлуоресцентный уплотнитель

ddH2O

Экспериментальный дизайн

А. Положительный контраст

DNaseI обрабатывает положительные контрольные таблетки. DNase I может переваривать одноцепочечную или двухцепочечную ДНК, подвергающуюся воздействию конца 3 'OH, вызывая гибель клеток человеком. Можно проводить каждый эксперимент один раз. (Для проверки проблематичности данной экспериментальной операции и комплекта реагентов)

В. Отрицательные контрасты

Использование без TDT Тунель Enzyme Реакция Buffer， Заменить TdT DDH2O Enzyme。 (В основном, чтобы исключить неспецифическое окрашивание, вызванное аутопсией клеток, операционными процессами и другими причинами; и отрегулировать интенсивность экспозиции съемки.)

С. Экспериментальная группа обработки

Экспериментальная группа работает нормально в соответствии с инструкциями.

D. Экспериментальная контрольная группа

Экспериментальная группа работает нормально в соответствии с инструкциями.

Экспериментальные шаги

1 Готовность выборки:

(1) Для стенных клеток или клеточных мазков

a. Очистка PBS 1 раз.

Примечание: Если вы беспокоитесь о том, что клетки клеточного мазка плохо прикреплены, вы можете высушить образцы, чтобы сделать клетки более прочными.

b. Фиксирование: Добавление умеренного количества 4% полиформальдегида (PBS приготовление), 4°C фиксированный 30 мин. Очистка PBS 2 раза.

c. Проницаемость: Добавить соответствующее количество 0,4% TritonX - 100 (PBS - сборка), Проницаемость при комнатной температуре 20 мин. Очистка PBS 2 раза.

d. Шаг поворота 2.TUNEL Реакция.

(2) Для суспензии или клеточной суспензии

А. Сбор клеток (3 - 5×10)⁶Клетки), 1000rpm центрифуг 5 мин, PBS очищается 2 раза.

b. Фиксирование: Добавьте умеренное количество 4% полиформальдегида (PBS - композиция) для адекватной суспензии клеток, 4°C фиксированный 30 мин. 2000 rpm центрифуга 5 мин, PBS очистка 2 раза.

c. Проницаемость: Добавить соответствующее количество 0,4% TritonX - 100 (PBS - сборка), Проницаемость при комнатной температуре 20 мин. 2000 rpm центрифуга 5 мин, PBS очистка 2 раза.

d. Шаг поворота 2.TUNEL Реакция.

(3) Профили парафиновой ткани

a. Нанесение парафиновых срезов на раму для нарезания и установка 60 мин в печь при температуре 60°C.

b. Депарафинирование и гидратация: образцы срезов последовательно помещаются в ксилол I (10 мин) ксилол II (10 мин) 100% этанол I (5 мин) 100% этанол II (5 мин) 95% этанол (5 мин) 90% этанол (5 мин) 80% этанол (5 мин) 70% этанол (5 мин) ddH2O промывание 5 мин, промывание 2 раза.

Примечание: ксилол токсичен и летучий, пожалуйста, сделайте это в вентиляционном шкафу.

c. высушить жидкость вокруг образца среза с помощью фильтрующей бумаги и окружить профиль образца иммуногистолярной ручкой, чтобы просочиться и пометить вниз по течению.

Примечание: Если в ходе последующих экспериментальных операций обнаруживается, что контурный круг иммуногистолярной штриховки поврежден, его необходимо своевременно дополнить.

d. Проницаемость: раствор Proteinase K 2 мг / мл разбавляется с помощью PBS до конечной концентрации 40 мкг / мл в пропорции 1: 50, добавляя 100 мкл на каждый образец, чтобы раствор покрывал всю область выборки и высиживался при температуре 37 °С в течение 30 мин.

Примечание: Proteinase K пропускает клеточные и нуклеотидные мембраны, позволяя последующим этапам окрашивания полностью проникать в ядро клетки для реакции и повышать эффективность маркировки. Слишком длительное время инкубации увеличивает риск того, что тканевые срезы выпадают с несущей на последующих этапах промывки, а слишком короткое время может привести к недостаточной проницаемости, что повлияет на эффективность маркировки. Для получения лучших результатов концентрация Proteinase K, время инкубации и температура должны быть оптимизированы в зависимости от различных типов образцов тканей.

e. Образцы среза погружаются в 1×PBS дрейфуют три раза по 5 минут каждый, отсасывая лишнюю жидкость фильтрующей бумагой и оставляя обработанные образцы влажными в мокрой коробке.

Примечание: Этот шаг должен быть очищен от Proteinase K, иначе это серьезно нарушит последующие реакции маркировки.

f. Шаг поворота 2. реакция TUNEL.

(4) Замороженные срезы тканей

a. Фиксирование: вынуть замороженный срез и вернуться к температуре до комнатной температуры. Образец среза погружается в 4% полиформальдегид (PBS - композиция), комнатная температура фиксируется на 30 мин. Образцы разреза погружаются в 1×PBS и стираются три раза по 10 минут каждый.

Примечание: Если вы беспокоитесь, что формальдегидная очистка не является чистой, это влияет на конечный эффект окрашивания. После фиксации формальдегида можно добавить соответствующее количество 2 мг / мл гликановой кислоты для очистки 10 мин, нейтрализовать остаточную фиксированную жидкость, а затем провести очистку PBS.

b. Высушить жидкость вокруг образца среза с помощью фильтрующей бумаги и окружить профиль образца иммуногистолярной ручкой, чтобы просочиться вниз по течению и пометить.

Примечание: Если в ходе последующих экспериментальных операций обнаруживается, что контурный круг иммуногистолярной штриховки поврежден, его необходимо своевременно дополнить.

c. Проницаемость: раствор Proteinase K 2 мг / мл разбавляется PBS до конечной концентрации 40 мкг / мл в пропорции 1: 50, добавляя 100 мкл на каждый образец, так что раствор покрывает всю область выборки и высиживается при температуре 37 °С в течение 20 мин.

Примечание: Proteinase K пропускает клеточные и нуклеотидные мембраны, что позволяет красить реагенты на последующих этапахПолный доступ к ядру клетки для реакции, повышение эффективности маркировки. Слишком длительное время инкубации увеличивает риск того, что тканевые срезы выпадают с несущей на последующих этапах промывки, а слишком короткое время может привести к недостаточной проницаемости, что повлияет на эффективность маркировки. Для получения лучших результатов концентрация Proteinase K, время инкубации и температура должны быть оптимизированы в зависимости от различных типов образцов тканей. Если оптимизация концентрации Proteinase K и времени инкубации все еще не улучшает эффект окрашивания, образец может быть погружен в 1% Triton X - 100 (PBS), а комнатная температура способствует просачиванию 3 - 5 мин; После этого образец разреза погружается в 1×PBS и дрейфует три раза по 5 минут каждый.

d. Образцы среза погружаются в 1×PBS дрейфуют три раза по 5 минут каждый, отсасывая лишнюю жидкость фильтрующей бумагой и оставляя обработанные образцы влажными в мокрой коробке.

Примечание: Этот шаг должен быть очищен от ProteinaseK, иначе это серьезно нарушит последующие реакции маркировки.

е. Шаг поворота 2.TUNEL Реакция.

(5) Положительная обработка (эта стадия выполняется только с положительным контрастом, другие образцы непосредственно проходят стадию реакции TUNEL)

Разбавить 10 × DNase I Buffer до 1 × DNase I Buffer с помощью ddH2O в масштабе 1: 10.

b. Капли 100 мкл 1 × DNase I Buffer на обработанный образец, охватывающий всю область выборки с балансом комнатной температуры 5 мин.

c. разбавление рабочей жидкости DNase I (2 U / мкл) до конечной концентрации 20 U / мл 1: 100 с помощью 1×DNase I Buffer.

d. Выбросить баффера, добавить рабочую жидкость DNaseI с концентрацией 100 мкл 20U / мл и инкубацию при комнатной температуре в течение 15 мин.

е. Выбросите рабочую жидкость DNase I и очистите PBS 2 раза.

f. Шаг поворота 2. реакция TUNEL.

2 Реакция TUNEL

(1) Приготовление реактивной жидкости TUNEL (т.е.

(2) Для стенных клеток, клеточных мазков или тканевых срезов

a. В каждый образец добавляется 50 мкл реактивной жидкости TUNEL, которая равномерно покрывает образец. Подходящее время для фотоинкубации при температуре 37°C (рекомендованное время окрашивания клеток 15 - 30minh, рекомендованное время окрашивания тканей 1h).

Примечание: 50 мкл Реакционная жидкость TUNEL подходит для покрытия, среза или 96 - дырочной пластины (другие различные диафрагмы могут правильно регулировать объем реактивной жидкости TUNEL, покрывая клетки). Если образец, подлежащий проверке, является покрытием, срезом или в 24 -, 12 - или 6 - пористой пластине, он может быть разрезан с помощью антииспарительной пленки или с помощью самопроверки или другого подходящего материала на круглую пластическую пластину с меньшим отверстием, капля с реакцией TUNEL покрывает образец, предотвращая испарение реактора TUNEL и равномерно покрывая образец реакцией TUNEL.

b. Выбросить реактивный раствор TUNEL, после очистки PBS 2 раза, затем 0,1% Тритон X-100 (Составлено PBS, содержащее 5 мг / мLBSA) Очищается 3 раза по 5 мин каждый, так что свободные неактивные маркеры могут быть очищены более чистым.

c. (необязательно) В каждый образец добавляется краска DAPI с умеренной концентрацией 5 мкг / мл, избегающая света при комнатной температуреИнкубация5min。 После завершения окрашивания, отбросите краситель DAPI, PBS очищается 2 раза по 5 минут каждый.

d. (необязательно) Обломки: 20 мкл антифлуоресцентного уплотнителя на каплю образца (антифлуоресцентный)Калицирующий уплотнитель может быть неприменим к некоторым красителям, и перед экспериментом рекомендуется провести предварительные экспериментальные испытания.Секс), накройте стеклянную пленку, мягко постучите по крышке с тупым концом пинцета и удалите пузырьки, чтобы сделать обложку wanВсеА.

e. Высасывать лишнюю жидкость из фильтрующей бумаги и добавлять 100 мкл в область выборки. ПБС сохраняет образец влажным,Сразу же наблюдайте под флуоресцентным микроскопом.

(3) Для суспензии или клеточной суспензии

a. Добавление 50 мкл реактора LTUNEL в каждую пробирку для мягкой суспензии клеток, инкубация при температуре 37°C для предотвращения света15-30min。 Каждые 10 минут с помощью микродетектора мягко взвесить клетки.

b. 2000 rpm центрифуга 5 мин, сброс реактора TUNEL 0,1% Тритон X-100(Составление PBS, содержащее 5 мг / мл BSA) Очистка 2 раза, по 5 мин каждый, так плаватьОтсоединение от неактивных маркеров может быть очищено более чисто.

c. В каждую пробную трубку добавляется 100 мкл красителя DAPI с концентрацией 5 мкг / мл при комнатной температуре и 5 мин.

d. Добавить 400 мкл Перевисящие клетки PBS, немедленно обнаруженные с помощью проточного цитометра или после взятия мазкаНаблюдение под флуоресцентным микроскопом.

Меры предосторожности

Перед использованием, пожалуйста, мгновенно центрифугируйте продукт до основания трубы, а затем проведите последующие эксперименты.

2. Время окрашивания может быть соответствующим образом сокращено, когда окрашивание имеет более тяжелый фон или когда неспецифическое окрашивание очевидно.

3. В ходе эксперимента рекомендуется добавить как отрицательные, так и положительные контрольные группы.

4. При использовании компонента А носите маску, перчатки, если вы контактируете с кожей, немедленно промывайте большим количеством воды.

5.Флуоресцентные красители имеют проблемы с закалкой, пожалуйста, обратите внимание, насколько это возможно, чтобы избежать света, чтобы замедлить закалку флуоресценции.

Продукт ограничен научными исследованиями, не может использоваться для клинической диагностики или лечения, не может использоваться для продуктов питания или лекарств, не может храниться в обычных жилых помещениях.

Для вашей безопасности и здоровья, пожалуйста, наденьте лабораторный костюм и используйте одноразовые перчатки.