артикулА.B1013/4/5/6

Условия храненияА.Хранение - 20°C, компонент А должен избегать света, чтобы избежать повторного замерзания и таяния.

Компоненты продукцииА.

Описание продукта

Отличительной особенностью цитопатии является клеточная хромосома.Деградация ДНК, которая является очень специфической и регулярной, приводит к образованию фрагментов ДНК различной длины, которые в несколько раз больше, чем 180 bp - 200 bp, что проявляется в специфической трапезной диаграмме Ладдера в электрофорезе агаринового геля. В этом наборе используется метод TUNEL для каталитического включения YF в конце 3 - OH сломанной ДНК в апоптотических клетках с использованием концевого метафермента дезоксирибонуклеотида (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT). ®/ Cy-dUTP，YF ®/ ДНК, отмеченная Cy - dUTP, может быть замечена непосредственно с помощью флуоресцентного микроскопа или количественно измерена с помощью проточного цитометра. Метод TUNEL может избирательно обнаруживать опавшие клетки, а не некротические клетки или клетки с разрывом цепи ДНК, вызванным облучением и медикаментозной терапией. Отметить dUTP (например,земляГао Синь- dUTP,жизньВу-dUTP）， Тестирование на месте, которое может быть проведено напрямую, является более быстрым и прямым средством обнаружения.

Этот набор широко используется для обнаружения клеточного апоптоза в замороженных или парафиновых срезах, а также для обнаружения апоптоза культивируемых клеток стенки или суспензии. Избирательное обнаружение апоптотических клеток, а не некротических клеток или вызванных облучением и медикаментозной терапиейКлетки с разорванной цепочкой ДНК. Этот набор реагентов обнаруживает отмирание клеток, занимает короткое время, просто шаг реакции окрашивания, после стирки можно обнаружить.

способ применения

Экспериментальные материалы (собственные)

Буфер PBS (pH ~ 7.4)

0.4% Triton X - 100 (PBS - сборка)

0.1% Triton X - 100 (PBS, включая 5 мг / мLBSA)

4%многоДжу Цзюань（Составление PBS)

Иммуногенетическая ручка

Растворитель для депарафинирования (образец парафинового среза)

Реактор для обработки парафиновых срезов

антифлуоресцентный уплотнитель

ddH2O

Экспериментальный дизайн

А. Положительный контраст

DNaseI обрабатывает положительные контрольные таблетки. DNase I может переваривать одноцепочечную или двухцепочечную ДНК, подвергающуюся воздействию конечностей 3 'OH, вызывая гибель клеток человеком. Можно проводить каждый эксперимент один раз. (Для проверки проблематичности данной экспериментальной операции и комплекта реагентов)

В. Отрицательные контрасты

Использование не содержитTDT Enzyme TUNEL Reaction Buffer заменяет TDT Enzyme ddH2O. (В основном, чтобы исключить неспецифическое окрашивание, вызванное аутопсией клеток, операционными процессами и другими причинами; и отрегулировать интенсивность экспозиции съемки.)

С. Экспериментальная группа обработки

Экспериментальная группа работает нормально в соответствии с инструкциями.

D. Экспериментальная контрольная группа

Экспериментальная группа работает нормально в соответствии с инструкциями.

Экспериментальные шаги

1 Готовность выборки:

（1) Для стенных клеток или клеточных мазков

a. Очистка PBS 1 раз.

Примечание: Если вы беспокоитесь о том, что клетки клеточного мазка плохо прикреплены, вы можете высушить образцы, чтобы сделать клетки более прочными.

b. Фиксированная: присоединение к умеренному количеству 4%многоДжу Цзюань（Состав PBS), 4°C фиксированный 30 мин. Очистка PBS 2 раза.

c. Проницаемость: Добавить соответствующее количество 0,4% TritonX - 100 (PBS - сборка), Проницаемость при комнатной температуре 20 мин. Очистка PBS 2 раза.

d. Шаг поворота 2.TUNEL Реакция.

（2) Для суспензии или клеточной суспензии

А. Сбор клеток (3 - 5×10)⁶Всего клеток),1000rpm центрифуга 5 мин, PBS очищается 2 раза.

b. Фиксированная: присоединение к умеренному количеству 4%многоДжу Цзюань（Составлено PBS) Полностью тяжелые подвесные клетки, 4°C фиксированные 30 мин. 2000 rpm центрифуга 5 мин, PBS очистка 2 раза.

c. Проницаемость: Добавить соответствующее количество 0,4% TritonX - 100 (PBS - сборка), Проницаемость при комнатной температуре 20 мин. 2000 rpm центрифуга 5 мин, PBS очистка 2 раза.

d. Шаг поворота 2.TUNEL Реакция.

（3) Профили парафиновой ткани

a. Нанесение парафиновых срезов на раму для нарезания и установка 60 мин в печь при температуре 60°C.

b. Депарафинирование и гидратация: образцы срезов последовательно помещаются в ксилол I (10 мин) ксилол II (10 мин) 100% этанол I (5 мин) 100% этанол II (5 мин) 95% этанол (5 мин) 90% этанол (5 мин) 80% этанол (5 мин) 70% этанол (5 мин) ddH2O промывание 5 мин, промывание 2 раза.

Примечание: ксилол токсичен и летучий, пожалуйста, сделайте это в вентиляционном шкафу.

c. высушить жидкость вокруг образца среза с помощью фильтрующей бумаги и окружить профиль образца иммуногистолярной ручкой, чтобы просочиться и пометить вниз по течению.

Примечание: Если в ходе последующих экспериментальных операций обнаруживается, что контурный круг иммуногистолярной штриховки поврежден, его необходимо своевременно дополнить.

d. Проницаемость: раствор Proteinase K 2 мг / мл разбавляется с помощью PBS до конечной концентрации 40 мкг / мл в пропорции 1: 50, добавляя 100 мкл на каждый образец, чтобы раствор покрывал всю область выборки и высиживался при температуре 37 °С в течение 30 мин.

Примечание:Протейнасе K проникает в клеточную и нуклеарную мембраны, что позволяет последующим этапам окрашивания полностью проникать в ядро клетки для реакции и повышать эффективность маркировки. Слишком длительное время инкубации увеличивает риск того, что тканевые срезы выпадают с несущей на последующих этапах промывки, а слишком короткое время может привести к недостаточной проницаемости, что повлияет на эффективность маркировки. Для получения лучших результатов концентрация Proteinase K, время инкубации и температура должны быть оптимизированы в зависимости от различных типов образцов тканей.

e. Образцы среза погружаются в 1×PBS дрейфуют три раза по 5 минут каждый, отсасывая лишнюю жидкость фильтрующей бумагой и оставляя обработанные образцы влажными в мокрой коробке.

Примечание: Этот шаг должен бытьProteinase K очищается, иначе это может серьезно нарушить последующие реакции маркировки.

f. Шаг поворота 2. реакция TUNEL.

（4) Замороженные срезы тканей

a. Фиксирование: вынуть замороженный срез и вернуться к температуре до комнатной температуры. Загрузить образец в 4%многоДжу Цзюань（Составление PBS), комнатная температура фиксирована на 30 мин. Образцы разреза погружаются в 1×PBS и стираются три раза по 10 минут каждый.

Примечание: Если вы беспокоитесь, что формальдегидная очистка не является чистой, это влияет на конечный эффект окрашивания. Можно добавлять умеренное количество после фиксации.2 мг/млГаньАН кислотамыть10min， Нейтрализуйте остаточную фиксированную жидкость, а затем промывайте PBS.

b. Высушить жидкость вокруг образца среза с помощью фильтрующей бумаги и окружить профиль образца иммуногистолярной ручкой, чтобы просочиться вниз по течению и пометить.

Примечание: Если в ходе последующих экспериментальных операций обнаруживается, что контурный круг иммуногистолярной штриховки поврежден, его необходимо своевременно дополнить.

c. Проницаемость: раствор Proteinase K 2 мг / мл разбавляется PBS до конечной концентрации 40 мкг / мл в пропорции 1: 50, добавляя 100 мкл на каждый образец, так что раствор покрывает всю область выборки и высиживается при температуре 37 °С в течение 20 мин.

Примечание:Proteinase K проникает в клеточные и нуклеотидные мембраны, что позволяет красить реагенты на последующих этапахПолный доступ к ядру клетки для реакции, повышение эффективности маркировки. Слишком длительное время инкубации увеличивает риск того, что тканевые срезы выпадают с несущей на последующих этапах промывки, а слишком короткое время может привести к недостаточной проницаемости, что повлияет на эффективность маркировки. Чтобы добиться лучших результатов,Концентрация Proteinase K, время инкубации и температура должны быть оптимизированы в зависимости от различных типов образцов тканей. Если оптимизация концентрации Proteinase K и времени инкубации все еще не улучшает эффект окрашивания, образец может быть погружен в 1% Triton X - 100 (PBS), а комнатная температура способствует просачиванию 3 - 5 мин; После этого образец разреза погружается в 1×PBS и дрейфует три раза по 5 минут каждый.

d. Образцы среза погружаются в 1×PBS дрейфуют три раза по 5 минут каждый, отсасывая лишнюю жидкость фильтрующей бумагой и оставляя обработанные образцы влажными в мокрой коробке.

Примечание: Этот шаг должен бытьПротейнасек промывается, иначе это серьезно нарушит последующие реакции маркировки.

е. Шаг поворота 2.TUNEL Реакция.

（5) Положительная обработка (эта стадия выполняется только с положительным контрастом, другие образцы непосредственно проходят стадию реакции TUNEL)

Разбавить 10 × DNase I Buffer до 1 × DNase I Buffer с помощью ddH2O в масштабе 1: 10.

b. Капли 100 мкл 1 × DNase I Buffer на обработанный образец, охватывающий всю область выборки с балансом комнатной температуры 5 мин.

c. разбавление рабочей жидкости DNase I (2 U / мкл) до конечной концентрации 20 U / мл 1: 100 с помощью 1×DNase I Buffer.

d. Выбросить баффера, добавить рабочую жидкость DNaseI с концентрацией 100 мкл 20U / мл и инкубацию при комнатной температуре в течение 15 мин.

е. Выбросите рабочую жидкость DNase I и очистите PBS 2 раза.

f. Шаг поворота 2. реакция TUNEL.

2 Реакция TUNEL

（1) Приготовление реактивной жидкости TUNEL (т.е.

（2) Для стенных клеток, клеточных мазков или тканевых срезов

a. В каждый образец добавляется 50 мкл реактивной жидкости TUNEL, которая равномерно покрывает образец. Подходящее время для фотоинкубации при температуре 37°C (рекомендованное время окрашивания клеток 15 - 30minh, рекомендованное время окрашивания тканей 1h).

Примечание:Реакционный раствор TUNEL 50 мкл подходит для покрытия, среза или 96 диафрагмы (другие различные диафрагмы могут правильно регулировать объем реактивного раствора TUNEL, покрывая клетки). Если образец, подлежащий проверке, является покрытием, срезом или в 24 -, 12 - или 6 - пористой пластине, он может быть разрезан с помощью антииспарительной пленки или с помощью самопроверки или другого подходящего материала на круглую пластическую пластину с меньшим отверстием, капля с реакцией TUNEL покрывает образец, предотвращая испарение реактора TUNEL и равномерно покрывая образец реакцией TUNEL.

b. После удаления реактивной жидкости TUNEL, после очистки PBS 2 раза, затем очистка 3 раза с использованием 0,1% Triton X - 100 (PBS, в котором содержится 5 мг / мLBSA) по 5 мин каждый, так что свободный неорганизованный маркер может быть очищен более чистым.

c. (необязательно) В каждый образец добавляется краска DAPI с умеренной концентрацией 5 мкг / мл, избегающая света при комнатной температуреИнкубация5min。 После завершения окрашивания, отбросите краситель DAPI, PBS очищается 2 раза по 5 минут каждый.

d. (необязательно) Обломки: 20 мкл антифлуоресцентного уплотнителя на каплю образца (антифлуоресцентный)Прокаливающий уплотнитель может быть неприменим к некоторым красителям, перед экспериментом рекомендуется провести предварительное экспериментальное тестирование соответствия), накрыть стекло, мягко ударить по нему тупым концом пинцета и удалить пузырьки, чтобы сделать уплотнение

Ван - все.

e. высасывать излишки жидкости из фильтрующей бумаги и добавлять 100 мкл PBS в область выборки, чтобы сохранить образец влажным,Сразу же наблюдайте под флуоресцентным микроскопом.

（3) Для суспензии или клеточной суспензии

a. Добавление 50 мкл реактора LTUNEL в каждую пробирку для мягкой суспензии клеток, инкубация при температуре 37°C для предотвращения света15-30min。 Каждые 10 минут с помощью микродетектора мягко взвесить клетки.

b. 2000 rpm центрифуга 5 мин, сброс реактора TUNEL, 0,1% Triton X - 100（Состав PBS, содержащий 5 мг / мл BSA) очищается 2 раза по 5 мин каждый, так что свободные неактивные маркеры могут быть очищены более чистым.

c. В каждую пробную трубку добавляется 100 мкл красителя DAPI с концентрацией 5 мкг / мл при комнатной температуре и 5 мин.

d. Добавление 400 мкл PBS - тяжелых висячих клеток для немедленного обнаружения с помощью проточного цитометра или после взятия мазкаНаблюдение под флуоресцентным микроскопом.

Меры предосторожности

Перед использованием, пожалуйста, мгновенно центрифугируйте продукт до основания трубы, а затем проведите последующие эксперименты.

2. Время окрашивания может быть соответствующим образом сокращено, когда окрашивание имеет более тяжелый фон или когда неспецифическое окрашивание очевидно.

3. В ходе эксперимента рекомендуется добавить как отрицательные, так и положительные контрольные группы.

4. При использовании компонента А носите маску, перчатки, если вы контактируете с кожей, немедленно промывайте большим количеством воды.

5.Флуоресцентные красители имеют проблемы с закалкой, пожалуйста, обратите внимание, насколько это возможно, чтобы избежать света, чтобы замедлить закалку флуоресценции.

Продукт ограничен научными исследованиями, не может использоваться для клинической диагностики или лечения, не может использоваться для продуктов питания или лекарств, не может храниться в обычных жилых помещениях.

Для вашей безопасности и здоровья, пожалуйста, наденьте лабораторный костюм и используйте одноразовые перчатки.