Молекулярные эксперименты: CLIP ультрафиолетовый клей, связанный с иммунным осаждением

I. Технический обзор

CLIP (перекрестная иммунопреципитация) 交联Иммуносакция(Через сочетаниеУФ - соединениеМетод иммуноконъюгирования для анализа точек связывания белков с РНК.

II. ТЕХНИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ

Технология CLIP использует ультрафиолетовое излучение, чтобы сделать внутриклеточную РНК ковалентно связанной с РНК - связывающим белком (RBP), а затем обогатить фрагменты РНК, связанные с конкретным RBP, путем иммуноосаждения, а затем получить информацию о местах связывания РНК и связанных последовательностях RBP в организме с помощью таких шагов, как обратная транскрипция и высокопроизводительное секвенирование.

III. Сценарии применения

Исследование взаимодействия белка - RNA: Определение мест связывания РНК и связанных последовательностей конкретного белка в организме, раскрывающее механизм действия белка в посттранскрипционной регуляции.

Исследования, связанные с болезнями: сравнивая РНК - связывание RBP в нормальных и патологических состояниях, обнаруживаются события РНК - связывания и сети регулирования, связанные с возникновением и развитием заболевания.

Исследования и разработки в области лекарственных средств: обеспечение новых целей и механизмов действия для исследований и разработок лекарственных средств, которые помогают разрабатывать лекарства для конкретных РНК - связывающих белков или регулируемых ими молекул РНК.

Биоинформатический анализ: путем биоинформатического анализа данных CLIP - seq, прогнозирования точек связывания и режимов связывания РНК - связывающих белков, построения сети регулирования РНК и т.д.

IV. Преимущества технологии

Тестирование in vivo: способность улавливать взаимодействия белков и РНК в живых клетках, которые действительно отражают физиологическое состояние организма.

Высокая специфичность и строгая очистка: очищение скрещивающихся комплексов с помощью специфических антител или этикеток может эффективно удалять неспецифически связанные РНК и белки и повышать достоверность результатов.

В сочетании с высокопроизводительным секвенированием: в сочетании с технологией высокопроизводительного секвенирования можно идентифицировать точки связывания РНК RBP и связанные последовательности в пределах всего генома для получения обширной информации.

V. Тип выборки

Свежие клетки (клетки, прикрепленные к стенкам / взвешенные клетки), образцы клеток после ультрафиолетового скрещивания.

VI. Потребности в выборке

Образцы клеток: около 1 × 10 ^ 7 (может быть 1 чашка 10 см или храниться в виде взвешенных клеток в центрифуге, или 1 бутылка T75);

Образцы сцепленных клеток: 254 нм, 150 мДж / см² стандартные UV - сцепленные клетки.

VII. Подготовка и транспортировка образцов

Образцы живых клеток: образцы свежих клеток, хранящиеся в чашках Петри / Т75 / центрифуге, могут быть перевезены с более близкого расстояния экспресс - почтой при комнатной температуре (не позднее следующего дня) и могут быть отправлены в город или лично;

Образцы клеток после скрещивания: перевозка замороженного сухого льда при температуре 80°C.

VIII. Необходимые реактивы

Тестирование с использованием антител класса ChIP.

IX. Экспериментальный цикл

1 - 2 недели (без секвенирования)

X. Прочее

При выборе RT PCR для последующего тестирования необходимо указать место последующего тестирования.