Молекулярное взаимодействие: эксперимент Pull - Down

I. Технический обзор

Эксперимент Pull - DownТакже известный как эксперимент по вытягиванию, это метод экстракорпоральной сродства и очистки.

II. ТЕХНИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ

Привязка белка к определенной матрице (например,СефарозаНо когда клеточный экстракт проходит через матрицу, рецепторные белки, которые могут взаимодействовать с этим фиксированным белком, адсорбируются, а « примеся», которые не были адсорбированы, вытекают из стиральной жидкости. Адсорбированный белок может быть переработан путем изменения условий очистки или стирки.

III. Сценарии применения

Проверка известных белковых взаимодействий: посредством экспериментов Pull - down с известными белками - приманками и потенциально взаимодействующими белками - добытчиками можно проверить их взаимодействие, если их присутствие обнаруживается.

Скрининг взаимодействия неизвестных белков: эксперимент Pull - down с белком - приманкой с клеточным крекингом или другой белковой смесью, а затем идентификация связывающего белка, который может отобрать неизвестный белок, взаимодействующий с белком - приманкой.

Изучение состава белковых комплексов: выделение белковых комплексов в эксперименте Pull - down, а затем идентификация белков в комплексе позволяет определить состав белковых комплексов.

Изучение взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами: Используя технологии Pull - down и Pull - down ДНК, можно изучить взаимодействие белков с ДНК, РНК, например, связывание факторов транскрипции с инициаторами, связывание РНК - связывающих белков с РНК и т.д.

IV. Преимущества технологии

Можно определить, могут ли белки назначения и белки обнаружения взаимодействовать напрямую.

V. Тип выборки

Свежие клетки (стенные клетки / взвешенные клетки), замороженные клетки, замороженные ткани, образцы крекинга.

VI. Потребности в выборке

Образцы клеток: около 5 × 10 ^ 6 (могут быть 2 чашки 6 см или храниться в виде взвешенных клеток в центрифуге, или 2 бутылки T25);

Замороженные ткани: около 40 мг;

Образцы крекинга: концентрация белка не менее 2 мг / мг, общее количество белка не менее 3 мг.

VII. Подготовка и транспортировка образцов

Образцы живых клеток: Ближайшие расстояния могут предоставить свежие образцы, которые будут культивироваться в чашке Петри / T25 бутылок / центробежных труб свежих образцов клеток при комнатной температуре экспресс (не позднее следующего дня), город может быть мигающим или лично доставлен, более дальние, могут быть заморожены клетки сухого льда при температуре 80°C;

Образец ткани & образец крекинга: перевозка замороженного сухого льда при температуре 80°C.

VIII. Необходимые реактивы

Если проводится WB - тест, необходимо предоставить соответствующие антитела.

IX. Экспериментальный цикл

3 - 4 недели (без масс - спектрометрии)

X. Прочее

RNA-Pull-down、DNA-Pull-down、GST-Pull-down， В частности, необходимо уведомить род и целевой белок для последующего тестирования масс - спектрометрии Western blot / белка, а стоимость экстракорпоральной экспрессии слитых белков должна быть рассчитана на основе индивидуальной оценки конкретного целевого белка.

Факторы транскрипции, некоторые эксперименты также могут использовать рекомбинантные экспрессированные белки.

VI. Потребности в выборке

Образцы клеток: около 1 × 10 ^ 7 (может быть 1 чашка 10 см или храниться в виде взвешенных клеток в центрифуге, или 1 бутылка T75);

Замороженные ткани: около 400 мг;

Растительная ткань: около 2 г; цитогенный белок, очищенный транскрипционный фактор, рекомбинантный экспрессивный белок и т. Д.: Каждая мембрана обеспечивает не менее 50 уль, концентрация не менее 0,5 мг / мл.

VII. Подготовка и транспортировка образцов

Образцы живых клеток: свежие образцы клеток, содержащиеся в чашках Петри / T75 бутылок / центробежных трубах, могут быть перевезены с помощью экспресс - доставки при комнатной температуре (не позднее следующего дня) на более близком расстоянии, в городе могут быть мигающими или лично доставлены, а на более дальнем расстоянии могут быть заморожены клетки сухого льда при температуре 80°C;

Образцы тканей & другие образцы жидкостей: перевозка замороженного сухого льда при температуре 80°C.

VIII. Необходимые реактивы

Ассоциированные белковые специфические антитела 50 ul и выше, концентрация более 0,5 мг / мл.

IX. Экспериментальный цикл

2 - 3 недели

X. Прочее

Последовательность зонда, если нет последовательности зонда, пожалуйста, предоставьте информацию о ДНК - связывающих белках или соответствующую литературу.