Эксперименты молекулярного взаимодействия: CUT & amp; Tag Целевая резка и маркировка

I. Технический обзор

CUT & TAG - это высокочувствительная эпигеномная аналитическая технология, основанная на целевом разрезе хроматина и маркировке на основе антител, которая преодолевает узкие места, такие как низкая чувствительность, высокий фоновый шум и большой спрос на образцы в традиционном ChIP - seq, и может анализировать характеристики хроматина, такие как модификация гистона и комбинация факторов транскрипции на одноклеточном уровне, чтобы стать новым эпигенетическим исследованиемнаправлениеА.

II. ТЕХНИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ

CUT & TAG обеспечивает точный анализ хроматина с помощью четырех ключевых реакций:

1.Целевое позиционирование антител:Специфический монорезистентный (например, антитела H3K4me3) связывается с областью целевого хроматина, Protein A / G - дианти - переносным комплексом Tn5 роторных ферментов (с секвенированными соединениями).

2. Целевая резка и маркировка:Трансферазы Tn5 под руководством антител проводят двухцепочечную резку ДНК и соединение соединения с целевым хромосомом в диапазоне: около 50 - 300 bp с каждой стороны целевого участка.

3. Выделение фрагментов ДНК:Протаза K переваривает хроматин, который соединяется и высвобождает фрагменты ДНК с разъемами.

4. Создание и секвенирование библиотеки:PCR расширяет целевые сегменты, создавая библиотеку секвенирования Illumina, глубина секвенирования: ~ 20 million reads / sample (на 50% меньше, чем ChIP - seq).

III. Сценарии применения

CUT & TAG выявляет эпигенетические различия между различными подгруппами в микросреде опухоли на одноклеточном уровне.

Например:

Тройно - отрицательный рак молочной железы: суперадъюнктоны, регулируемые FOXA1, были обнаружены с помощью одноклеточного CUT & TAG, специфичной активации в субтипах базисного типа, которые управляют экспрессией ключевых генов EMT (эпителиально - интерстициальная трансформация), таких как SNAI1, и способствуют метастазированию.

Острая миелоидная лейкемия: Отслеживание образцов костного мозга пациентов с рецидивом и выявление динамических изменений в модификации H3K4me1 в стволовых клетках CD34 +, которые предвещают появление устойчивости к химиотерапии и обеспечивают новые цели для кажущейся целевой терапии.

Эпископическое перепрограммирование эмбрионального развития: CUT & TAG отслеживает динамические процессы создания модификации гистонов в раннем эмбриональном развитии.

Эмбрионы у мышей перед сном: было обнаружено, что H3K9me3 начинает осаждаться на стадии 2 - cell, отдавая приоритет маркировке транскриптивных подмножеств (например, LINE - 1), которые модифицируются для поддержания стабильности генома путем подавления трансплантационной активности.

Эмбриональные стволовые клетки человека: картирование динамики H3K27ac в нейродифференциации, определение местоположения усиленных сетей, регулируемых SOX2 и OCT4, и выявление критических узлов многоэнергетического выхода.

Регулирование функции иммунных клеток: анализ поверхностных основ дифференциации Т - клеток и функциональных состояний.

7.Т - клеточное истощение: в модели хронической вирусной инфекции было обнаружено, что H3K27ac истощающих CD8 + Т - клеток необычайно обогащен в созвездиях PD - 1 и TIM - 3, которые напрямую регулируются фактором транскрипции TOX.

Регулирующие Т - клетки (Treg): комбинированный ATAC - seq показывает, что FOXP3 стабилизирует ингибирующую функцию клеток Treg путем модификации H3K4me3, процесс, основанный на синергическом подавлении H3K27me3 при посредничестве EZH2.

IV. Преимущества технологии

Высокая чувствительность (100 - клеточное тестирование): Tn5 - ротаназа режет и соединяет секвенирующие соединения непосредственно в целевом месте, избегая случайных потерь, вызванных фрагментацией ДНК (ультразвуковое дробление) в ChIP - seq. По сравнению с ChIP - seq, соотношение сигнала и шума CUT & TAG увеличилось в 8 раз (S / N = 12: 1 vs 1.5: 1), а количество обнаруженных пиков разницы увеличилось на 40%.

Однощелочное разрешение и точное позиционирование: комплекс антитела - Tn5 режет только ДНК вблизи точки связывания (±50 bp), в то время как ультразвуковое дробление ChIP - seq производит случайные фрагменты 200 - 500 bp. В сочетании с p53 - битовым анализом CUT & TAG обнаруживает отдельные узкие пики (ширина пика 30 bp), в то время как ChIP - seq показывает широкий пик (ширина пика 200 bp), первый из которых может быть точно расположен в центре базовой последовательности TTGCCT.

Одноклеточная и пространственно - эпитектическая совместимость: Объединённая платформа 10x Genomics, которая с помощью микроконтроля потока связывает отдельные клетки с комплексом антител - Tn5 в масляных каплях, обеспечивает построение одноклеточной карты H3K27ac (Nature Methods, 2022).

Новая технология Spatial CUT & Tag позволяет локализовать субструктурированное распределение H3K4me3 на тканевых срезах, например, визуализировать модификации, связанные с активностью нейронов в гиппокампе, в срезе мозга мышей.

V. Тип выборки

Свежие клетки (клетки, прикрепленные к стенкам / взвешенные клетки), замороженные клетки, замороженные ткани.

VI. Потребности в выборке

Образцы клеток: около 100 000 (может быть 1 отверстие в 24 - дырочной пластине или храниться в центрифуге в виде взвешенных клеток);

Замороженные ткани: около 10 - 20 мг.

VII. Подготовка и транспортировка образцов

Образцы живых клеток: Ближайшие могут предоставить свежие образцы, которые будут культивироваться в чашках Петри / центробежных трубах свежих образцов клеток при комнатной температуре экспресс (не позднее следующего дня), город может мигать или лично доставлять; Перевозка сухого льда в замороженных клетках на больших расстояниях - 80°C;

Образец ткани: перевозка замороженного сухого льда при температуре 80°C.

VIII. Необходимые реактивы

Антитела уровня ChIP (антитела уровня IF также могут быть выбраны, когда их нет)

IX. Экспериментальный цикл

1 - 2 недели (без секвенирования)

X. Прочее

Последующее обнаружение Rrealtime PCR / секвенирование