Эксперименты молекулярного взаимодействия: RIP (иммунное осаждение РНК)

I. Технический обзор

Технология RIP (РНК Immunoprecipitation, РНК - иммунное осаждение) является ключевым экспериментальным методом для изучения внутриклеточных взаимодействий РНК с белками, который может выявить функциональные механизмы РНК - связывающего белка (RBP) в посттранскрипционной регуляции.

II. ТЕХНИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ

RIP использует антитела к целевым белкам для осаждения соответствующих комплексов RNA - белков, а RT - PCR - проверка или секвенирование РНК, связанных с комплексом, путем разделения и очистки, в результате чего результаты более биологически обоснованы.

III. Сценарии применения

Фундаментальные механизмы: анализ функций РНК - связывающих белков (например, AGO2, комплексов Polycomb) и сети регулирования РНК.

Исследования заболеваний: сравните различия между болезнями и RNA - белками в нормальных образцах и обнаружите потенциальные биомаркеры (например, связанные с раком lncRNA).

3. Разработка лекарственных средств: оценка влияния лекарственных средств на взаимодействие РНК - белков, ускорение целевого скрининга.

IV. Преимущества технологии

Высокая чувствительность: обнаружение слабых взаимодействий РНК с белками с низким содержанием.

Динамический диапазон широк: от небольшого количества клеток (например, 5×10⁷) до сложных образцов тканей.

Многогрупповое использование: создание многомерной сети регулирования в сочетании с RNA - Seq, CLIP - Seq или ChIP - Seq.

V. Тип выборки

Свежие клетки (клетки, прикрепленные к стенкам / взвешенные клетки), замороженные клетки, замороженные ткани, образцы постклеточных клеток.

VI. Потребности в выборке

Образцы клеток: около 1 × 10 ^ 7 (может быть 1 чашка 10 см или храниться в виде взвешенных клеток в центрифуге, или 1 бутылка T75);

Замороженные ткани: около 70 мг; образцы скрещивающихся клеток: обработка клеток с использованием 1% формальдегидного скрещивания.

VII. Подготовка и транспортировка образцов

Образцы живых клеток: свежие образцы клеток, содержащиеся в чашках Петри / T75 бутылок / центробежных трубах, могут быть перевезены с помощью экспресс - доставки при комнатной температуре (не позднее следующего дня) на более близком расстоянии, в городе могут быть мигающими или лично доставлены, а на более дальнем расстоянии могут быть заморожены клетки сухого льда при температуре 80°C;

Образец ткани & образец клетки после скрещивания: перевозка замороженного сухого льда при температуре 80°C.

VIII. Необходимые реактивы

Тестирование с использованием антител класса ChIP.

IX. Экспериментальный цикл

1 - 2 недели (без секвенирования)

X. Прочее

При выборе RT PCR для последующего тестирования необходимо указать место последующего тестирования.

Формальдегидные скрещивающиеся клетки конкретные шаги: (1) Добавление формальдегида с конечной концентрацией 1% в чашку Петри клетки, инкубация при температуре 37°C в течение 10 минут; Используйте холодные DPBS, содержащие [1 мм PMSF, 1 мкг / мл ингибиторов пептидазы и 1 мкг / мл пепстатина A] дважды. Клетки выбрасываются в 2 мл холодного DPBS, содержащего ингибиторы протеазы, и передаются в центробежные трубки для замораживания и отправки.