Эксперимент молекулярного взаимодействия: иммунное осаждение хроматина ChIP

I. Технический обзор

ChIP (иммунное осаждение хроматина) является ключевой технологией для изучения взаимодействия белков и ДНК, которая широко используется в таких областях, как транскрипционные факторы в сочетании с идентификацией местоположения, эпигенетическим модификационным анализом и т.д.

II. ТЕХНИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ

Используя специфические комбинации антигенных антител, фрагменты ДНК, которые связываются с белком назначения, осаждаются и могут реально отражать регулируемые белки, связанные с последовательностью ДНК.

III. Сценарии применения

1. Исследование регулирования транскрипции: выявление факторов транскрипции (например,p53, NF - Каппа B) ДНК - связывающие участки.

Эпигенетика: анализ модификации гистонов (например,Роль H3K27me3 в генетическом молчании.

3. Механизмы заболевания: изучение закономерностей связывания генома аномальных белков (например, MYC) при раке.

4. Можно иИспользование технологий QPCR и SEQ.

IV. Преимущества технологии

Благодаря формальдегидному скрещиванию ChIP захватывает динамическое связывание белка с ДНК в реальном состоянии в клетке, избегая ложноотрицательных или ложноположительных экспериментов in vitro, особенно для изучения кратковременных событий связывания, таких как транскрипционные факторы.аСпецифические антитела могутИТочное обогащение фрагментов ДНК, связанных с целевыми белками, в сочетании с qPCR или секвенированием (ChIP - seq) для достижения обнаружения на уровне до тысячи клеток (например, оптимизированный набор реагентов), со значительной чувствительностьюИ имеет широкое применение.

V. Тип выборки

Свежие клетки (клетки, прикрепленные к стенкам / взвешенные клетки), замороженные клетки, замороженные ткани, образцы постклеточных клеток.

VI. Потребности в выборке

Образцы клеток: около 1 × 10 ^ 7 (может быть 1 чашка 10 см или храниться в виде взвешенных клеток в центрифуге, или 1 бутылка T75);

Замороженная ткань: около 70 мг;

Образцы сцепленных клеток: обработка клеток с использованием 1% формальдегида сцепления.

VII. Подготовка и транспортировка образцов

Образцы живых клеток: свежие образцы клеток, содержащиеся в чашках Петри / T75 бутылок / центробежных трубах, могут быть перевезены с помощью экспресс - доставки при комнатной температуре (не позднее следующего дня) на более близком расстоянии, в городе могут быть мигающими или лично доставлены, а на более дальнем расстоянии могут быть заморожены клетки сухого льда при температуре 80°C;

Образец ткани & образец клетки после скрещивания: перевозка замороженного сухого льда при температуре 80°C.

VIII. Необходимые реактивы

Тестирование с использованием антител класса ChIP.

IX. Экспериментальный цикл

1 - 2 недели (без секвенирования)

X. Прочее

При выборе RT PCR для последующего тестирования необходимо указать место последующего тестирования.

Формальдегидные скрещивающиеся клетки конкретные шаги: (1) Добавление формальдегида с конечной концентрацией 1% в чашку Петри клетки, инкубация при температуре 37°C в течение 10 минут; Используйте холодные DPBS, содержащие [1 мм PMSF, 1 мкг / мл ингибиторов пептидазы и 1 мкг / мл пепстатина A] дважды. Клетки выбрасываются в 2 мл холодного DPBS, содержащего ингибиторы протеазы, и передаются в центробежные трубки для замораживания и отправки.