Эксперименты молекулярного взаимодействия: иммуноконъюнктивирование IP / CO - IP

I. Технический обзор

IP (Immunoprecipitation, Immunoprecipitation) и Co - IP (Co - Immunoprecipitation, Co - Immunoprecipitation) являются основными технологиями для изучения функций и взаимодействий белков и широко используются в области молекулярной и клеточной биологии.

II. ТЕХНИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ

IP через специфические антитела и целевые белкиСочетание, использование антител для выделения белка - мишени (то есть антигена), чтобы обнаружить экспрессию определенного белкаВ то время как CO - IP проверяет взаимодействие между белками на основе IP. Захватив один белок (белок - приманка), обнаруживая взаимодействующие с ним белки (белки - мишени),В результатеСпецифическое обогащение белков - мишенейЗатем исследуются белки в комплексе, которые взаимодействуют с известными белками.

III. Сценарии применения

• IP: обогащение белков с низким содержанием для масс - спектрометрической идентификации (IP - MS), проверки специфичности антител.

• Co - IP: Изучение транскрипционных факторных комплексов, киназы - субстративных взаимодействий и проверка известных взаимодействий или выявление новых партнеров взаимодействия (например, комплексов сигнальных путей).

IV. Преимущества технологии

• IP: имеет высокую специфичность, зависит от специфического сочетания антител - антигенов.

• Гибкость: Поддержка необязательных магнитных шариков (простая в эксплуатации, автоматизированная совместимость) или агара (высокая емкость связывания).

• Ко- ИП: Внутренняя аутентичность: изучается взаимодействие белков в естественном состоянии организма, которое реагирует на более реальные взаимодействия белков.

V. Тип выборки

Свежие клетки (стенные клетки / взвешенные клетки), замороженные клетки, замороженные ткани, образцы крекинга.

VI. Потребности в выборке

• Образцы клеток: около 5 × 10 ^ 6 (могут быть 2 чашки 6 см или храниться в виде взвешенных клеток в центрифуге, или 2 бутылки T25);

• Замороженная ткань: около 40 мг; образец крекинга: концентрация белка не менее 2 мг / мг, общее количество белка не менее 3 мг.

VII. Подготовка и транспортировка образцов

• Образцы живых клеток: Ближайшие расстояния могут предоставить свежие образцы, которые будут культивироваться в чашке Петри / T25 бутылок / центробежных труб свежих образцов клеток при комнатной температуре экспресс (не позднее следующего дня), город может быть мигающим или лично доставлен, более дальние, могут быть заморожены клетки сухого льда при температуре 80°C;

• Образец ткани & образец крекинга: перевозка замороженного сухого льда при температуре 80°C.

VIII. Необходимые реактивы

Тестирование на антитела IB и IP.

IX. Экспериментальный цикл

1 - 2 недели (без масс - спектрометрии)

X. Прочее

Последующее тестирование Western blot / белкового масс - спектра